【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学和生物工程领域，涉及提高vlp载体产量的方法和系统。
技术介绍
1、近年来，因流行性疾病爆发的不可预测性，对快速干预策略的需求在不断增加。目前基于蛋白的疫苗虽然在工艺上具有标准化和模块化的优势，然而其纯化依赖于抗原特性，技术路线优化和效果确认所需时间较长。相比之下，基于dna或mrna的核酸疫苗只需获得新菌株基因信息便可开始生产，因此可以迅速启动针对流行病的应对措施，具有更强的通用性。此类技术平台不依赖于特定序列，大大减少了针对新型病原体或突变体适应性调整所需的时间和成本。就核酸疫苗而言，dna疫苗需要入核。该递送方法虽然在小动物模型中有效，但在包括人在内的大型哺乳动物中效率很低，往往需要非常大的剂量，还存在造成基因组变异等潜在的安全问题[9]。相比之下，mrna仅需要细胞质递送，且在各哺乳动物系统中效率均较高。
2、由于mrna分子性质不稳定性，且与细胞膜表面均带有负电荷，将mrna递送到细胞内部需要解决递送途中的酶解以及静电排斥造成的膜屏障。因此，需要开发适合的系统，对其进行封装并传递到目标位置。最常使用的递送方式包括借助基于脂质的纳米载体，例如脂质体、脂质纳米乳剂、脂质纳米颗粒(lnp)等。含有可电离阳离子脂质的lnp尺寸小、血清稳定性高、生理ph下表面ζ电位低，且在酸性ph值下(体内环境)带有阳离子电荷，从而能够通过静电相互作用提高rna的封装效率。阳离子脂质体表面带有的正电荷也有利于与抗原呈递细胞(例如树突状细胞)的负电荷表面相互作用，便于抗原的呈递和激发t细胞应答[1]。然而，在这
3、另一方面，病毒样颗粒(vlp)受到越来越多的关注。病毒样颗粒是由具有自组装能力的一种或多种分子构成的病毒衍生结构，模拟了病毒颗粒的大小和形态。特别是对于复制缺陷型vlp而言，由于缺少病毒全基因组，它们不能在宿主细胞中复制，更为安全。虽然在vlp的疫苗用途中，大多采用vlp直接作为免疫原，然而特定vlp在药物递送和基因治疗方面的应用也在迅速发展。
4、就vlp载体的制备而言，病毒封装辅助蛋白的表达可在多种活细胞或无细胞表达系统中进行，并自发组装为纳米尺度的中空颗粒形态。所述表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞表达系统。细菌、酵母表达系统的生产成本低、细胞生长快、蛋白表达水平高、易于实现规模化，然而，在这些宿主中病毒封装辅助蛋白难以进行正确折叠以及翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)，因此产生的vlp与天然病毒的结构差异较大，递送效率较低[3]。昆虫表达系统蛋白产量较高，然而n糖基化模式与哺乳动物细胞存在差异，对于某些vlp而言不能实现正确的糖基化。植物表达系统产生的vlp主要用于抗原呈递，而难以用作载体。此外，囊膜病毒vlp需要从宿主细胞获得脂膜并从细胞出芽，在植物宿主中难以实现此类vlp成熟过程。哺乳动物表达系统是生产vlp的最有吸引力的平台。作为天然宿主，哺乳动物细胞提供的翻译后修饰机制能够保证vlp的正确折叠。然而，由于哺乳动物表达系统中vlp产量极低、表达周期长，难以实现规模化生产，因此，尽管异源表达系统存在各种问题，目前的工业生产中仍较多使用异源表达系统。
技术实现思路
1、针对目前哺乳动物表达系统中vlp载体产量极低造成的生产成本高的问题，在第一方面，本专利技术提供了一种提高哺乳动物表达系统中病毒样颗粒产量的方法，其中，所述病毒样颗粒为作为载体的水疱性口炎病毒(vsv)病毒样颗粒，所述方法包括将包含如下序列的质粒转染至哺乳动物宿主细胞：
2、a)加帽酶-rna聚合酶表达盒，所述加帽酶-rna聚合酶表达盒包含第一启动子序列以及嵌合型加帽酶-rna聚合酶编码序列，其中，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶包含单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域；所述单体rna聚合酶选自于由t7 rnap、t3 rnap、k1.5 rnap、k1e rnap、k11 rnap、sp6 rnap以及phi15 rnap所组成的组；所述病毒加帽酶选自于由蓝舌病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、棘阿米巴多噬拟态病毒加帽酶、竹花叶病毒加帽酶以及痘苗病毒加帽酶所组成的组；
3、b)病毒封装辅助蛋白表达盒，所述病毒封装辅助蛋白表达盒包含各病毒封装辅助蛋白的编码序列以及驱动所述病毒封装辅助蛋白表达的第二启动子，其中，所述病毒封装辅助蛋白为水疱性口炎病毒的g蛋白、n蛋白、p蛋白以及l蛋白；所述各第二启动子各自独立地为所述单体rna聚合酶识别的启动子；
4、c)目的基因表达片段，所述目的基因表达片段为所述g蛋白编码序列被所述目的基因序列替换的vsv基因组cdna；其中，所述目的基因表达片段的5’端具有第三启动子，所述第三启动子为所述单体rna聚合酶识别的启动子。
5、在一些优选的实施方式中，所述加帽酶-rna聚合酶的单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域之间具有(g4s)4连接肽。
6、在一些优选的实施方式中，所述单体rna聚合酶为t7 rna聚合酶。
7、在一些优选的实施方式中，所述病毒加帽酶为非洲猪瘟np868加帽酶。
8、在一些优选的实施方式中，在所述病毒封装辅助蛋白表达盒中，在所述各病毒封装辅助蛋白的编码序列的3’端具有3’utr以及t7终止子序列。
9、在一些优选的实施方式中，所述目的基因表达片段的3’端具有t7终止子序列。
10、在一些优选的实施方式中，所述目的基因表达片段的3’端具有丁型肝炎病毒核酶以及t7终止子序列。
11、在一些优选的实施方式中，出于进一步提高vlp产量的目的，在所述转染中，所述加帽酶-rna聚合酶编码序列、所述目的基因表达片段、所述g蛋白编码序列、所述n蛋白编码序列、所述p蛋白编码序列以及所述l蛋白编码序列的摩尔比为(1.5-23.3):(2.9-11.7):(4.6-60.8):8.1:10.3:1；更优选为11.7:5.8:60.8:8.1:10.3:1。
12、在一些实施方式中，在所述病毒封装辅助蛋白表达盒中，在所述各病毒封装辅助蛋白的编码序列的3’端具有人β-珠蛋白3’非翻译区、polya(40)、丁型肝炎病毒核酶以及t7终止子序列。
13、在一些优选的实施方式中，所述加帽酶-rna聚合酶表达盒、各病毒封装辅助蛋白表达盒以及所述目的基因表达片段存在于不同的质粒。
14、在第二方面，本专利技术涉及一种具有提高的病毒样颗粒产量的哺乳动物表达系统，其中，所述病毒样颗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高哺乳动物表达系统中病毒样颗粒产量的方法，其特征在于，所述病毒样颗粒为作为载体的水疱性口炎病毒病毒样颗粒；所述方法包括将包含如下序列的质粒转染至哺乳动物宿主细胞：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽酶-RNA聚合酶的单体RNA聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域之间具有(G4S)4连接肽；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述病毒封装辅助蛋白表达盒中，在所述各病毒封装辅助蛋白的编码序列的3’端具有人β-珠蛋白3’非翻译区、polyA(40)、丁型肝炎病毒核酶以及T7终止子序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述加帽酶-RNA聚合酶表达盒、各病毒封装辅助蛋白表达盒以及所述目的基因表达片段存在于不同的质粒。
5.一种用于表达病毒样颗粒的哺乳动物表达系统，其特征在于，所述病毒样颗粒为作为载体的水疱性口炎病毒病毒样颗粒；所述系统包含：
6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述加帽酶-RNA聚合酶的单体RNA聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域之间具有(G4S)4连接肽；>
7.如权利要求5所述的系统，其特征在于，在所述病毒封装辅助蛋白表达盒中，在所述各病毒封装辅助蛋白的编码序列的3’端具有人β-珠蛋白3’非翻译区、polyA(40)、丁型肝炎病毒核酶以及T7终止子序列。
8.如权利要求5-7中任一项所述的系统，其特征在于，所述加帽酶-RNA聚合酶表达盒、各病毒封装辅助蛋白表达盒以及所述目的基因表达片段存在于不同的质粒。
9.权利要求1-4中任一项所述的方法或权利要求5-8中任一项所述的系统在制备基因表达载体或RNA疫苗方面的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种提高哺乳动物表达系统中病毒样颗粒产量的方法，其特征在于，所述病毒样颗粒为作为载体的水疱性口炎病毒病毒样颗粒；所述方法包括将包含如下序列的质粒转染至哺乳动物宿主细胞：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽酶-rna聚合酶的单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域之间具有(g4s)4连接肽；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述病毒封装辅助蛋白表达盒中，在所述各病毒封装辅助蛋白的编码序列的3’端具有人β-珠蛋白3’非翻译区、polya(40)、丁型肝炎病毒核酶以及t7终止子序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述加帽酶-rna聚合酶表达盒、各病毒封装辅助蛋白表达盒以及所述目的基因表达片段存在于不同的质粒。
5.一种用于表达病毒样颗粒的哺乳...
【专利技术属性】
技术研发人员：娄春波，项延会，娄秋莉，王卫军，李婷婷，刘子明，张浩千，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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