本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法。本发明专利技术提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因能够明显促进菌株对PHA的合成和积累，显著提高PHA的产量；利用本发明专利技术提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因构建的工程化罗氏真养菌的细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对提高PHA的发酵生产效率和降低生产成本具有重要的应用价值。效率和降低生产成本具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法
[0001]本专利技术是申请日为2022年4月6日、申请号为202210751056.5、专利技术名称为“表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法”的专利申请的分案申请。本专利技术涉及微生物
，具体涉及提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因，以及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法。
技术介绍
[0002]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生、可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。聚羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，是由细菌产生的商业上有用的复合生物聚合物，具有多种潜在应用，包括用作可生物降解/热塑性材料、某些抗生素有机合成的手性中心来源以及用作药物递送和骨替代的基质等。3
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羟基丁酸与3
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羟基己酸共聚酯(PHBHHx，简称PHBH)，也是PHA中的一种，以不溶性微球状颗粒形式存在于细胞质中。
[0003]罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，也称Cupriavidus necator)是研究PHA合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于PHB生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，菌株可以大量积累PHB；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，PHB的合成则会受到影响。目前，PHB在罗氏真养菌体内的合成途径已被阐述清楚：酯酰辅酶A(Acyl
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CoA)在phaA(β
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酮基硫解酶)的作用下合成乙酰乙酰辅酶A(acetoacetyl CoA)，再通过phaB(乙酰乙酰辅酶A还原酶)合成3
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羟基丁酸。菌株的发酵生产性能是影响PHA生产的关键因素，因此，开发有利于PHA合成和积累的基因和菌株具有重要意义。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供能够提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因，以及用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程化微生物。
[0005]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
[0007](1)第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
[0008](2)第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
[0009](3)第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
[0010](4)第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天
冬酰胺或组氨酸；
[0011](5)第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
[0012]本专利技术提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比存在的突变，可包含上述(1)～(5)中任选的一种突变，也可包含上述(1)～(5)中涉及突变的任意两个、三个、四个或五个的组合。
[0013]本专利技术通过实验证明，含有上述单一突变位点的变体以及含有任意两个、三个、四个或五个突变位点的组合的变体均能够显著提高菌株的生物量和PHA的含量，进而显著提高PHA的产量。
[0014]第二方面，本专利技术提供编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子。
[0015]基于上述提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子的核苷酸序列，编码同一氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子均在本专利技术的保护范围内。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3
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28任一所示。
[0017]第三方面，本专利技术提供含有以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的表达盒由启动子、编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子以及终止子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中也可不包含终止子，或者含有增强子等其他转录、翻译调控元件。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制性载体和非复制型载体。携带上述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中提供了含有上述核酸分子、表达盒或载体的大肠杆菌细胞和罗氏真养菌细胞，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
[0021]第四方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物PHA产量中的应用，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
[0022](1)第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
[0023](2)第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
[0024](3)第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
[0025](4)第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
[0026](5)第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3
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28任一所示。
[0028]上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
[0029]第五方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在构建生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的微生物中的应用。
[0030]基于本专利技术提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体能够提高微生物的PHA产量的功能，编码这些变体的核酸分子以及含有这些核酸分子的生物材料可以用于构建生产PHA或其衍生物的菌株。
[0031]本专利技术中，PHA的衍生物是指以PHA为前体物质合成的代谢产物。在PHA合成能力提高的情况下，以PHA为前体合成的代谢产物的产量通常也可相应地提高。
[0032]上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
[0033]在本专利技术的一些实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物PHA产量中的应用，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体为RKZ34011.1。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微生物为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。4.一种工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体为RKZ34011.1。5.根据权利要求4所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述表达通过以下任一种或多种方式实现：(1)导入包含所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的质粒；(2)在基因组中插入一个或多个拷贝的所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因。6.根据权利要求5所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因如SEQ ID NO.11所示。7.根据权利要求4～6任一项所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹进，王禺，谢小翠，张桦宇，吴雅琨，刘甜，唐平安，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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