7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在合成熊去氧胆酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及7β

【技术实现步骤摘要】
7
β
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体及其在合成熊去氧胆酸中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种高稳定性的来源于玫瑰球菌属(Roseococcus sp.)的7β
‑
羟基类固醇脱氢酶(7β
‑
HSDH)突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β
‑
羟基类固醇脱氢酶催化剂， 7β
‑
羟基类固醇脱氢酶或重组7β
‑
羟基类固醇脱氢酶催化剂在合成熊去氧胆酸中的应用，以及应用连续流填充床反应器系统催化7
‑
羰基石胆酸还原制备熊去氧胆酸的方法。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)的差向异构体，化学名为3α,7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷
‑
24
‑
酸，化学式 C
24
H
40
O4，是一种白色粉末状的固体，不溶于水，易溶于碱性溶液。其化学结构式如下所示：
[0003][0004]熊去氧胆酸化学结构式
[0005]熊去氧胆酸是一种在临床上常用于治疗肝内胆汁淤积症和胆固醇结石的活性药理成分(API)。目前，熊去氧胆酸主要从活熊胆中提取，或者以胆酸或鹅去氧胆酸为原料通过化学法来合成。活熊取胆法产率低，周期长，并且对黑熊的生理和心理造成双重折磨，有违人道主义。化学合成法在1954年被提出，并且经过了多次改进但仍然无法避免重金属等有害试剂的使用。随着生物技术的发展，利用生物催化技术合成药物活性成分由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，而得到极大关注。而近30年来，酶法合成熊去氧胆酸也被广泛报道，相对于前两种方法，酶法合成熊去氧胆酸具有高立体和区域选择性、反应条件温和、绿色可持续等优点而备受关注。全酶法合成熊去氧胆酸的原料是鹅去氧胆酸，相对于熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸廉价易得，全酶法合成熊去氧胆酸涉及两个反应：首先在7α
‑
羟类固醇脱氢酶的催化下，鹅去氧胆酸转化为7
‑
羰基石胆酸中间体；然后，通过7β
‑
羟基类固醇脱氢酶，将后者还原为熊去氧胆酸。两种酶都属于短链脱氢酶家族，是烟酰胺辅酶依赖型脱氢酶。相对于辅因子NADP(H)，NAD(H)是更加廉价和稳定的，使其成为大规模合成应用中脱氢酶的首选辅因子。
[0006]在实际的工业生产中，游离酶生物催化剂常常面临着热稳定性低、不耐有机溶剂、易受极端pH影响和易失活等问题，影响其在实际生产应用中的生产效率。随着生产工艺的不断发展，对于具有高催化性能酶催化剂的需求也在与日俱增，对酶应用的效率和经济性的要求也就越来越高。因此，这不仅需要增强酶活性、稳定性和生产力，还需要提高酶的可回收性和重复利用性。固定化酶在保持了酶特有的催化性能的同时，还具有稳定性高、分离回收操作简单、可重复使用等一系列优点。与传统的搅拌式反应器相比较，连续流填充床反
应器技术可以有效强化酶催化的生化反应过程，同时，连续流反应器与固定化酶的结合使酶催化的反应和酶的回收操作在同一个操作单元中完成，简化操作流程，并可降低产物对酶的抑制效应，提高酶催化剂的生产力。
[0007]2018年，许建和等对来自瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的Rt7β
‑
HSDH进行辅酶偏好性改造，通过理性设计，实现了Rt7β
‑
HSDH的辅因子特异性从NADPH 到NADH的翻转，得到NADH依赖型变体Rt7β
‑
HSDH
G39D/T17A
，打破了已有报道中7β
‑
HSDH都是NADPH依赖性酶的现状(ACS Catal.,2019,9:466
–
473)。随后， Arends等利用数据库挖掘策略，从Lactobacillus spicheri克隆出一个天然NADH依赖型7β
‑
HSDH(Ls7β
‑
HSDH)(ChemSusChem,2019,12:3192
–
3203)。然而， Rt7β
‑
HSDH
G39D/T17A
和Ls7β
‑
HSDH的比活力均小于6U/mg，仅能催化10g/L 7
‑
羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，难以实现工业规模化应用。2019年，Monti小组还发现了其他几种NADH依赖性7β
‑
HSDH，但尚未探索它们在酶促合成熊去氧胆酸中的应用(Adv.Synth.Catal.,2020,362:2474
–
2485)。
[0008]综上所述，利用7β
‑
羟基类固醇脱氢酶酶促合成熊去氧胆酸已被广泛报道，并取得了一定进展。酶法合成熊去氧胆酸具有选择性高和环境友好等优势，但是也存在许多不足之处。相对于NADPH依赖型7β
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羟基类固醇脱氢酶，目前已知的NADH 依赖型7β
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羟基类固醇脱氢酶存在着催化活性较低，底物和产物耐受浓度低、稳定性差以及生产效率低等问题。因此，还需要开发出催化性能更好的NADH依赖型 7β
‑
羟基类固醇脱氢酶，在此基础上制备具有高稳定性和催化性能的固定化酶，进而利用工程化手段强化7β
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羟基类固醇脱氢酶催化的生化反应过程，来实现熊去氧胆酸的高效经济合成，从而满足工业化应用需求。

技术实现思路

[0009]本专利技术所要解决的问题是针对现有技术中7β
‑
羟基类固醇脱氢酶的不足，通过挖掘、改造提供一种催化性能卓越的7β
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羟基类固醇脱氢酶突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β
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羟基类固醇脱氢酶催化剂，7β
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羟基类固醇脱氢酶或重组7β
‑
羟基类固醇脱氢酶催化剂在合成熊去氧胆酸中的应用，制备具有高稳定性和催化效率的7β
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羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶催化剂，以及构建高效酶法合成熊去氧胆酸的连续流填充床反应器系统，应用连续流填充床反应器系统催化7
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羰基石胆酸还原制备熊去氧胆酸的方法。本专利技术中，还结合辅因子NAD(H)回收再利用系统提高熊去氧胆酸的生物合成过程的经济性和绿色可持续性。
[0010]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0011]本专利技术的技术方案之一：
[0012]一种7β
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羟基类固醇脱氢酶突变体，其是如下(a)或(b)的蛋白质：
[0013](a)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高稳定性的7β
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羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其选自由以下氨基酸序列组成的蛋白质中的一种：(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第28位甘氨酸替换为丙氨酸；(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸；(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位苏氨酸替换为甘氨酸；(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸；(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第132位丙氨酸替换为谷氨酰胺；(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位缬氨酸替换为亮氨酸；(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第124位苏氨酸替换为缬氨酸；(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第135位缬氨酸替换为亮氨酸；(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，第124位苏氨酸替换为缬氨酸；(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸，第135位缬氨酸替换为亮氨酸；(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸。2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述7β
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羟基类固醇脱氢酶突变体。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。5.一种羟基类固醇脱氢酶催化剂，其特征在于，所述的羟基类固醇脱氢酶催化剂是以下的任意一种：(1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体或表达如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的7β
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羟基类固醇脱氢酶的重组表达转化体，分离获得的静息细胞；(2)如(1)所述的静息细胞冷冻干燥得到的冻干细胞；(3)如(1)所述的静息细胞破碎获得的7β
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羟基类固醇脱氢酶的粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，李春秀，李海鹏，杨秉义，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：