一种羰基还原酶及其在催化合成(R)-β-羟基十四烷酸甲酯反应中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种羰基还原酶，包含该羰基还原酶的重组表达载体，包含该重组表达载体的宿主细胞及其上述羰基还原酶、宿主细胞或宿主细胞的羰基还原酶粗酶提取液在催化合成(R)

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶及其在催化合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯反应中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种羰基还原酶及其在催化合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯反应中的应用。

技术介绍

[0002]奥利司他是一种有效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，也是目前国内唯一一个获批用于减重的口服药。其药效原理是通过抑制胃肠道胰脂肪酶活性，使食物中的脂肪尤其是甘油三酯不能够分解为游离脂肪酸和单酰基甘油，从而阻碍了脂肪的吸收。非中枢类减脂药物奥利司他凭借其药效好、安全性高等优势，已经受到越来越多的关注。
[0003](R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯作为合成奥利司他的医药中间体，市场需求量大，生物安全性要求高，因此生物酶转化作为一种绿色高效的合成方法成为人们的研究热点。
[0004]目前，利用生物法合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯主要是通过酶催化的手段来实现的。其中，中国专利CN109022473A中在质粒上表达大肠杆菌内源的短链醇脱氢酶，催化法制备高手性ee值的(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯。专利CN109097344A则采用来自于海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体进行酶催化，底物转化率达到95%以上。专利CN114854704A利用突变的短链醇脱氢酶作用于底物β
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羰基十四烷酸酯，进一步提高了底物的转化率和产物产率。
[0005]以上专利技术专利皆为通过生物酶转化的方法生产(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，相比较于化学法，酶法合成绿色安全，但以上专利多数都对细胞破碎后进行催化，并额外添加辅酶作为供氢体，耗时且反应成本高。

技术实现思路

[0006]鉴于以上技术存在的缺陷，本专利技术通过筛选寻找到可具有NADPH结合域的羰基还原酶，该还原酶来自于Rhodotorula toruloides ATCC 204091，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，该序列在NCBI数据库编码为EGU12837.1，为了提高该酶的催化活性，我们对其N端截短536个氨基酸，仅保留537
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786位氨基酸，截短后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。本专利技术筛选得到的高效的生物酶，通过对其进行截短优化表达后，能够特异性的催化底物β
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羰基十四烷酸甲酯生产奥利司他中间体(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，底物转化率可达到100%，获得的产物(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯纯度高达99%，产物浓度达到250 g/L。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种羰基还原酶，所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术的羰基还原酶，该酶是在SEQ ID NO.1的基础上进行截短改造，进一步提高了该酶对于β
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羰基十四烷酸甲酯的催化效率和稳定性，从而提高了底物的转化率，最终能够实现100%的底物转化率，产物浓度可达到250 g/L，纯度大于99%。
[0009]本专利技术还提供了一种重组表达载体，包含上述的羰基还原酶氨基酸序列。
[0010]本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含上述的重组表达载体。所述宿主细胞包括但
不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或酿酒酵母等所有可以用来表达异源蛋白的原核生物和真核生物。
[0011]本专利技术还提供了上述羰基还原酶、宿主细胞或宿主细胞的羰基还原酶粗酶提取液在催化合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯反应中的应用。
[0012]在催化合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯反应中的应用中，底物为β
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羰基十四烷酸甲酯。
[0013]作为一种优选地实施方式，反应体系中另外加入辅酶，其中，所述辅酶包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）或能产生NADH或NADPH的生物酶。
[0014]作为另一种优选地实施方式，加入所述的宿主细胞全细胞催化β
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羰基十四烷酸甲酯合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，其中，所述宿主细胞的重组表达载体还包含能产生NADH或NADPH的酶的核苷酸序列；其中，羰基还原酶和能产生NADH或NADPH的酶的表达形式包括组成型表达和诱导型表达。
[0015]通过将能产生NADH或NADPH的酶的核苷酸序列同时整合到包含有羰基还原酶氨基酸序列的重组表达载体内，相当于引入辅酶再生系统，替代人为外源添加辅酶，利用全细胞催化的方法替代细胞破碎方法进行酶法合成，降低了生产成本，同时也缩短了生产周期。
[0016]进一步优选地之一，以β
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羰基十四烷酸甲酯和葡萄糖作为底物，加入所述的宿主细胞全细胞催化β
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羰基十四烷酸甲酯合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，所述宿主细胞的重组表达载体还包含葡萄糖脱氢酶的编码基因。
[0017]该应用中，以葡萄糖作为底物，在葡萄糖脱氢酶作用下生成NADPH，葡萄糖脱氢酶与本专利技术所述羰基还原酶共同作用，实现将β
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羰基十四烷酸甲酯转化成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，同时实现NADP+和NADPH之间的循环利用。
[0018]以β
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羰基十四烷酸甲酯和葡萄糖作为底物，全细胞催化时，β
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羰基十四烷酸甲酯和葡萄糖的质量比为1:3
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3:1，宿主细胞菌体与β
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羰基十四烷酸甲酯的质量比为1：20以上。 PH控制为5.5
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9.0，催化温度控制为20℃
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50℃。葡萄糖和β
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羰基十四烷酸甲酯投料方式包括一次性投料和分批投料。
[0019]进一步优选之二，以β
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羰基十四烷酸甲酯和甲酸,或以β
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羰基十四烷酸甲酯和甲酸钠作为底物，加入所述的宿主细胞全细胞催化β
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羰基十四烷酸甲酯合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，所述宿主细胞的重组表达载体还包含甲酸脱氢酶的编码基因。
[0020]以β
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羰基十四烷酸甲酯和甲酸作为底物全细胞催化时，β
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羰基十四烷酸甲酯与甲酸的质量比为1:3至3:1 ，宿主细胞菌体与β
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羰基十四烷酸甲酯的质量比为1：20以上； PH控制为5.5
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9.0，催化温度控制为20℃...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的羰基还原酶氨基酸序列。3.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求 2所述的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或酿酒酵母。5.权利要求1所述的羰基还原酶、权利要求3
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4任一项所述的宿主细胞全细胞或权利要求3
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4任一项所述的宿主细胞的羰基还原酶粗酶提取液在催化合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯反应中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，底物为β
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羰基十四烷酸甲酯。7.根据权利要6所述的应用，其特征在于，加入所述宿主细胞全细胞催化β
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羰基十四烷酸甲酯合成(R)
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β
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羟基十四烷酸甲酯，其中，所述宿主细胞的重组表达载体还包含能产生NADH或NA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，马一榕，蒋发现，马志国，
申请(专利权)人：国蔷生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：