合成2制造技术

本发明专利技术公开了一种合成2

【技术实现步骤摘要】
合成2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，主要涉及到生产2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建及应用。

技术介绍

[0002]母乳通常被认为是婴儿最重要的营养来源，人乳寡糖(HMOs)作为母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分(含量约为5
ꢀ‑ꢀ
15g /L)，在促进婴儿肠道菌群的发育和防止病原体粘附上皮细胞方面起着关键作用。人乳寡糖包括2
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岩藻糖基乳糖（2
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FL），3
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岩藻糖基乳糖（3
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FL），乳
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N
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四糖（LNT），6
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唾液酸乳糖（6
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SL）等，他们可以促进双歧杆菌的生长并生成受体类似物，保护婴儿免受肠道病原体的感染。其中，2
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岩藻糖基乳糖（2
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fucosyllactose,2
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FL），是分泌型母乳中含量最高的人乳寡糖，约占人乳寡糖总量的30%，具有重要的营养和医学价值。目前，美国和欧盟食品安全监管机构已经批准在婴儿配方奶粉中添加2
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岩藻糖基乳糖作为营养补充剂，自2021年以来，中国也对2
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岩藻糖基乳糖作为食品添加剂新品种进行申报意见征求。由此可见，2
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岩藻糖基乳糖作为一种高价值的营养补充剂在未来婴幼儿奶粉市场上具有广阔的前景。
[0003]在过去十年中，人们尝试各种方法来生产2
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岩藻糖基乳糖，包括母乳分离、化学合成、酶转化和微生物发酵等。化学合成2
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岩藻糖基乳糖需要以L
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岩藻糖为底物经历四步反应合成岩藻糖基供体，以乳糖为底物经过两步反应生成乳糖受体，供体和受体再经历四步反应最终生成产物2
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岩藻糖基乳糖。此方法中需要以高成本的L
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岩藻糖作为底物，并历经多步反应，成本高，步骤繁琐，因此该法不适合大规模的应用生产。相比较于化学法，生物法目前主要采用酶法和微生物发酵法合成。酶法合成条件温和，但大多数方法中需要以GDP
‑
L
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岩藻糖作为底物，成本十分高昂。而微生物发酵法因其微生物可快速繁殖且易于培养，能够利用廉价的葡萄糖或甘油等碳源实现高价值的2
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岩藻糖基乳糖的生产等优点，已经成为当前工业生产的主要方法。中国专利CN115216500A，通过以葡萄糖为底物酶催化合成甘露糖
‑6‑
磷酸，后以甘露糖
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磷酸作为底物，添加乳糖、辅因子NADpH、GTP和GDP
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L
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岩藻糖合成途径的四个酶及α
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1 ,2
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岩藻糖基转移酶，酶催化反应得到2
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岩藻糖基乳糖。该方法需要通过两步法进行酶催化反应，反应涉及到8个酶的参与，且需要额外添加GDP
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L
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岩藻糖，催化步骤繁琐，经济成本高。中国专利CN114874964A中，大肠杆菌以甘油为碳源，乳糖作为底物从头合成2
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岩藻糖基乳糖，该方法避免了L
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岩藻糖的添加，降低了生产成本，但甘油作为柴油生产过程中的副产物，不适应于食品级2
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岩藻糖基乳糖的生产。中国专利CN114672448A，在大肠杆菌中以葡萄糖和乳糖作为混合碳源进行发酵并增强了辅因子的供应，2
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岩藻糖基乳糖胞外产量达到5.21 g/L，但该产量远不足以满足工业化要求。

技术实现思路

[0004]鉴于以上技术背景，本专利技术旨在通过基因工程手段获得一株温敏大肠杆菌，能够高产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，该大肠杆菌可通过温度调控糖酵解途径，平衡菌体的生长
与2
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岩藻糖基乳糖的生产。
[0005] 为了实现上述目的，本专利技术采用的方案是这样的，一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，以大肠杆菌为出发菌株，敲除了磷酸果糖激酶 I编码基因pfkA，将磷酸果糖激酶 II编码基因pfkB天然启动子替换成pR启动子，并将CI857阻遏蛋白编码基因整合至染色体上。
[0006]本专利技术通过敲除磷酸果糖激酶 I编码基因pfkA后，将磷酸果糖激酶 II编码基因pfkB的天然启动子替换成温度敏感的pR启动子，同时将阻遏蛋白CI857编码基因整合至染色体上，以诱导型启动子或组成型启动子pL启动CI857的表达。CI857蛋白在30℃条件下具有活性，可以抑制pR启动子；而在37℃条件下，CI857活性极低，接近失活，pR启动子失去阻遏蛋白的抑制作用，具备了启动基因转录的能力。鉴于此，我们通过控制温度，使重组菌在生长前期可以正常生长，增大菌体密度；在生长中后期，抑制糖酵解途径，让果糖
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磷酸更多地转向GDP
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L
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岩藻糖的合成，提高2
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岩藻糖基乳糖的前体供应能力。
[0007]具体地，所述的大肠杆菌选自大肠杆菌BL21(DE3)或者MG1655；所述CI857阻遏蛋白编码基因以诱导型启动子或组成型启动子进行表达。进一步优选地，CI857阻遏蛋白编码基因以诱导型启动子 Ptrc或PT7或Ptac进行诱导表达；或者CI857阻遏蛋白编码基因以组成型启动子pL或J23100进行组成型表达。
[0008]优选地，所述重组大肠杆菌菌株的β
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半乳糖苷酶编码基因lacZ和UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ已进行了敲除。大肠杆菌中β
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半乳糖苷酶编码基因lacZ的敲除，阻断了乳糖降解途径，UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ的敲除,阻断了GDP
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L
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岩藻糖的降解，从而实现糖基供体GDP
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L
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岩藻糖和糖基受体乳糖的积累。
[0009]优选地，通过过表达乳糖渗透酶编码基因lacY，增强乳糖进入胞内的能力，有利于糖基受体的供应。具体地，所述重组大肠杆菌菌株的乳糖渗透酶编码基因lacY进行了过表达修饰，过表达修饰方式包含通过质粒进行游离表达或整合在染色体上表达；进一步优选地，lacY以诱导型启动子Ptrc或PT7或Ptac进行诱导表达或组成型启动子J23119等进行组成型表达。
[0010]优选地，通过过表达GDP
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L
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岩藻糖合成途径编码基因以增强糖基供体的供应。所述重组大肠杆菌菌株的GDP
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L
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岩藻糖合成途径编码基因manC、man本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除了磷酸果糖激酶 I编码基因pfkA，将磷酸果糖激酶 II编码基因pfkB天然启动子替换成pR启动子，并将CI857阻遏蛋白编码基因整合至染色体上。2.根据权利要求1所述的一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)或者MG1655。3.根据权利要求1所述的一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述CI857阻遏蛋白编码基因以诱导型启动子或组成型启动子进行表达。4.根据权利要求1所述的一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述重组大肠杆菌菌株的β
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半乳糖苷酶编码基因lacZ和UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ已进行了敲除。5.根据权利要求1所述的一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述重组大肠杆菌菌株的乳糖渗透酶编码基因lacY已进行了过表达修饰，过表达修饰方式包含通过质粒进行游离表达或整合在染色体上表达。6.根据权利要求1所述的一种合成2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述重组大肠杆菌菌株的GDP
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L
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岩藻糖合成途径编码基因manC、manB、...

【专利技术属性】
技术研发人员：马一榕，黄兵，蒋发现，马志国，姚萌，
申请(专利权)人：国蔷生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：