发酵生产3-羟基丙酸和丙烯酸的方法技术

本发明专利技术公开了发酵生产3

【技术实现步骤摘要】
发酵生产3
‑
羟基丙酸和丙烯酸的方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物发酵
，具体地说，涉及一种发酵生产3
‑
羟基丙酸和丙烯酸的方法。

技术介绍

[0002]3‑
羟基丙酸是一种重要的平台化合物，是美国能源部公布的12种高附加值生物基平台化学品之一。以3
‑
羟基丙酸(3
‑
HP)作为单体，可以合成高性能的生物可降解材料聚3
‑
羟基丙酸(PHP)。同时，3
‑
羟基丙酸可以进一步用于合成丙烯酸、1,3
‑
丙二醇、丙二酸、丙二胺等。3
‑
羟基丙酸还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。
[0003]丙烯酸是一种具有广泛应用的化学品，是合成聚丙烯酸(盐)的关键原料。聚丙烯酸具有极强的吸水能力，被广泛用于婴儿尿布、卫生巾、失禁产品等。目前，丙烯酸的生产主要依赖于化学法，通常是通过丙烯的分段氧化获得，该过程容易产生大量杂质，在制备卫生制品以及创伤材料中这些杂质会影响产品的安全性。同时该过程依赖于化石资源，生产过程需要高温高压，产生大量的污染物和二氧化碳排放。因此，开发绿色、安全的丙烯酸生产技术，实现从廉价的生物质原料直接生产丙烯酸具有重要的工业应用潜力。
[0004]目前，利用生物法生产3
‑
羟基丙酸已有较多报道，但这些方法通常是利用克雷伯氏菌等微生物发酵甘油生产3
‑
羟基丙酸，近年来甘油价格高涨，使得该路线难以有充分的经济竞争力。也有文献通过丙二酰
‑
CoA路线或者β
‑
丙氨酸路线合成3
‑
羟基丙酸，但这些路线所获得的最终3
‑
羟基丙酸浓度低，难以满足工业生产的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种发酵生产3
‑
羟基丙酸和丙烯酸的方法。
[0006]本专利技术构思如下：通过在谷氨酸棒杆菌中引入甘油和3
‑
羟基丙酸的合成途径，实现从各种廉价的碳源如葡萄糖，蔗糖，糖蜜等到3
‑
羟基丙酸的高效转化。进一步地，专利技术人发现谷氨酸棒杆菌内源的ald基因编码的醛脱氢酶可以高效地催化3
‑
羟基丙醛的氧化产生3
‑
羟基丙酸，通过上调ald的表达，同时下调甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶gapA的表达，可以实现高产量的3
‑
羟基丙酸的生产。本专利技术还提供了将含有3
‑
羟基丙酸的发酵液直接转化产生丙烯酸的方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌中的醛脱氢酶基因ald被强化，且甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因gapA被弱化。
[0008]本专利技术中，基因强化的方式可选自以下1)～4)，或任选的组合：
[0009]1)通过导入具有所述基因的质粒；
[0010]2)通过增加微生物基因组中所述基因的拷贝数；
[0011]3)通过改变微生物基因组中所述基因的启动子序列；
[0012]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接。
[0013]本专利技术中，基因弱化的方式可选自以下a)～c)，或任选的组合：
[0014]a)通过将弱启动子与所述基因可操作地连接；
[0015]b)采用稀有密码子；
[0016]c)采用反义RNA。
[0017]进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌还过表达了二醇脱水酶基因pduCDEGH。
[0018]进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌还过表达了3
‑
磷酸脱氢酶基因gdp和甘油3
‑
磷酸酶基因gpp。
[0019]本专利技术中，
[0020]基因ald为：
[0021]A1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
[0022]A2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0023]A3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0024]A4)与A1)、A2)或A3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0025]基因gapA为：
[0026]B1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0027]B2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0028]B3)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0029]B4)与B1)、B2)或B3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0030]基因pduCDEGH为：
[0031]C1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0032]C2)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0033]C3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0034]C4)与C1)、C2)或C3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0035]基因gdp为：
[0036]D1)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
[0037]D2)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0038]D3)在严格条件下与SEQ ID NO:4所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸
序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0039]D4)与D1)、D2)或D3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0040]基因gpp为：
[0041]E1)SEQ ID NO:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌中的醛脱氢酶基因ald被强化，且甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因gapA被弱化；其中，基因ald为：A1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；A2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；A3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或A4)与A1)、A2)或A3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；基因gapA为：B1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；B2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；B3)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或B4)与B1)、B2)或B3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，基因强化的方式选自以下1)～4)，或任选的组合：1)通过导入具有所述基因的质粒；2)通过增加微生物基因组中所述基因的拷贝数；3)通过改变微生物基因组中所述基因的启动子序列；4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接。3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，基因弱化的方式选自以下a)～c)，或任选的组合：a)通过将弱启动子与所述基因可操作地连接；b)采用稀有密码子；c)采用反义RNA。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌还过表达了二醇脱水酶基因pduCDEGH，基因pduCDEGH为：C1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；C2)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；C3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
C4)与C1)、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宇，杨令霞，
申请(专利权)人：北京绿色康成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：