生产五胺基酮戊酸的大肠杆菌及生产五胺基酮戊酸的方法技术

本发明专利技术提供一种生产五胺基酮戊酸的大肠杆菌，其具有双倍的pdxY基因。本发明专利技术还提供一种生产五胺基酮戊酸的方法，其包含提供上述大肠杆菌；以及将该大肠杆菌接种于含有碳源、异丙基

【技术实现步骤摘要】
生产五胺基酮戊酸的大肠杆菌及生产五胺基酮戊酸的方法


[0001]本专利技术是关于一种生产五胺基酮戊酸的大肠杆菌及使用其生产五胺基酮 戊酸的方法，尤其是一种以基因重组方法制成的大肠杆菌。

技术介绍

[0002]5‑
胺基酮戊酸(5
‑
Aminolevulinic Acid)(以下简称ALA)是生物体中必需 的代谢中间体，ALA在农业领域有广泛的用途，例如，ALA可以作为除草剂、 杀虫剂、农作物生长的促进因子，此外，ALA也被运用于医疗诊断用途，例 如ALA可以用于作为癌细胞的标记物。目前ALA的生产方式主要是通过麸 胺酸棒状杆菌来生产ALA。

技术实现思路

[0003]然而，麸胺酸棒状杆菌的生长速度较慢，麸胺酸棒状杆菌需要较长的培 养时间才能达到较高的菌量，借此提升其ALA产量，亦即，麸胺酸棒状杆菌 的缓慢生长速度影响到ALA的生产效率。因此，如何开发出一种生长速度快 同时又能具有高ALA产量的菌株，仍为有待解决的问题。
[0004]本专利技术的目的即针对上述问题，提供一种大肠杆菌，其具有双倍的pdxY 基因，该大肠杆菌可生产五胺基酮戊酸。
[0005]如上所述的大肠杆菌，该大肠杆菌还包含RchemA基因。
[0006]如上所述的大肠杆菌，该大肠杆菌还包含pRARE质粒。
[0007]为达上述目的及其他目的，本专利技术提供一种大肠杆菌，其具有SEQ IDNO.1的序列，该大肠杆菌可生产五胺基酮戊酸。
[0008]如上所述的大肠杆菌，该大肠杆菌还具有SEQ ID NO.2的序列
[0009]如上所述的大肠杆菌，该大肠杆菌还包含pRARE质粒。
[0010]为达上述目的及其他目的，本专利技术提供一种生产五胺基酮戊酸的方法， 包含以下步骤：(a)提供如上所述的大肠杆菌；及(b)将该大肠杆菌接种于含 有碳源、异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷、甘胺酸、琥珀酸与吡哆醛的培养基中进 行培养，以产生五胺基酮戊酸。
[0011]如上所述的方法，该碳源为由葡萄糖及甘油组成的混合碳源。
[0012]如上所述的方法，该培养基中含有铁离子。
[0013]通过如上所述的生产五胺基酮戊酸的大肠杆菌及使用其生产五胺基酮戊 酸的方法，提供一种生长速度快同时具有高ALA产量的菌株以及一种能够快 速且高产量地生产ALA的方法。
附图说明
[0014]图1示出本专利技术实施例1所使用的CRIM质粒图谱。
[0015]图2示出本专利技术实施例1所使用的SITAG质粒图谱。
[0016]图3示出本专利技术实施例1的大肠杆菌PIECE的ALA生产效率测试中质粒拷 贝数。
[0017]图4示出本专利技术实施例1的大肠杆菌PIECE的ALA生产效率测试中生物 量。
[0018]图5示出本专利技术实施例1的大肠杆菌PIECE的ALA生产效率测试中大肠杆 菌PIEC的ALA产量。
[0019]图6示出本专利技术实施例2所使用的pSIT质粒图谱。
[0020]图7示出本专利技术实施例2的大肠杆菌RcGI与其他重组大肠杆菌的生长速率 的比较结果。
[0021]图8示出本专利技术实施例2的大肠杆菌RcGI与其他重组大肠杆菌的ALA产 量的比较结果。
[0022]图9示出本专利技术实施例2的大肠杆菌RcGI在不同时间点添加铁离子的生长 速率比较结果。
[0023]图10示出本专利技术实施例2的大肠杆菌RcGI在不同时间点添加铁离子的 ALA产量比较结果。
[0024]图11示出本专利技术实施例2的大肠杆菌RcGI的发酵罐量产效率测试结果。
[0025]图12示出本专利技术实施例3所使用的pCT
‑
PY质粒图谱。
[0026]图13示出本专利技术实施例3的大肠杆菌A
‑
RcYI的发酵罐量产效率测试结 果。
具体实施方式
[0027]为充分了解本专利技术的目的、特征及功效，通过下述具体的实施例，并配 合所附的图式，对本专利技术做一详细说明，说明如后：
[0028]实施例1的大肠杆菌PIECE
[0029]本实施例1提供一种大肠杆菌PIECE，PIECE菌株中包含一段额外插入 的大肠杆菌pdxy基因，亦即，PIECE菌株包含双倍的pdxy基因(本身的pdxy 基因与外加的pdxy基因)，pdxy基因会表达PdxY蛋白(即吡哆醛激酶)， PdxY蛋白能协助磷酸吡哆醛(以下称PLP)的合成，而PLP为ALA合成酶 (以下称ALAS)的辅因子。亦即，pdxy基因的表达量增加有助于大肠杆菌 的ALA产量的提升，同时，大肠杆菌的生长速度快，相较于麸胺酸棒状杆菌， 大肠杆菌能够以较短的时间生长到足够的菌量来生产更多的ALA。本实施例 1的PIECE菌株的制备方法如下所述。
[0030]首先，准备条件式复制整合模块化(conditional
‑
replication,integration,andmodular,CRIM)质粒以及大肠杆菌菌株BL21(DE3)。如图1所示，本实施例 1所使用的CRIM质粒为pHK
‑
Km，CRIM质粒中携带有启动子LacI和pdxY 基因而形成pHK
‑
PlacI
‑
pdxY
‑
Km质粒，本实施例1的pHK
‑
PlacI
‑
pdxY
‑
Km质 粒中携带有卡那霉素(kanamycin)基因。利用转化作用将该CRIM质粒中送入 大肠杆菌BL21(DE3)中。
[0031]上述pdxY基因的制备是通过PCR反应进行扩增。pdxy基因扩增所使用 的引物序列如下：正向引物序列为 5
’‑
GCGCTTATGAGTAGTTTGTTGTTGTTTAACG
‑3’
(SEQ ID NO.4)；反 向引物序列为5
’‑
ACTAGTTTATGCTTCCGCCAGCGGCGGCAA
‑3’
(SEQ IDNO.5)。
[0032]上述转化作用过程为先将大肠杆菌BL21(DE3)与CRIM质粒混合，接着 大肠杆菌BL21(DE3)与CRIM质粒的混合物以42℃热休克90秒，接着加入 LB溶液到前述混合物中温育1小时，最后将含有转化后大肠杆菌BL21(DE3) 的LB菌液涂布于LB琼脂培养基上。
[0033]转入大肠杆菌BL21(DE3)体内的CRIM质粒可以将pdxY基因与卡那霉素 基因整合
至大肠杆菌BL21(DE3)的HK022位点。如此一来便可制成本实施例 1的PIECE菌株。本实施例1的PIECE菌株是通过将PIECE菌株培养于含有 卡那霉素的LB琼脂培养基上进一步挑选而得。
[0034]为了避免含有卡那霉素基因的PIECE菌株进入到环境中因具有抗药性而 不易被消灭，因此需要进一步剔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌，其特征在于，其具有双倍的pdxY基因，所述大肠杆菌可生产五胺基酮戊酸。2.如权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌还包含RchemA基因。3.如权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌还包含pRARE质粒。4.一种大肠杆菌，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1的序列，所述大肠杆菌可生产五胺基酮戊酸。5.如权利要求4所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌还具有SEQ ID NO.2的序列。6.如权利要求5所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌还包含pRARE质...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴意珣，易盈甄，薛成凤，余紫瑄，
申请(专利权)人：吴意珣，
类型：发明
国别省市：