发酵生产γ-丁内酯或1,4-丁二醇的方法技术

本发明专利技术提供一种发酵生产γ

【技术实现步骤摘要】
发酵生产
γ
‑
丁内酯或1,4
‑
丁二醇的方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物发酵
，具体地说，涉及一种发酵生产γ
‑
丁内酯或1,4
‑
丁二醇的方法。

技术介绍

[0002]1,4
‑
丁二醇(BDO)是一种重要的有机化工和精细化工原料，被广泛用于制造各种聚酯、聚氨酯和聚醚多元醇等高分子材料，例如其是合成工程塑料聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)的关键单体，同时其也是合成生物可降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和PBAT的关键单体。近年来，随着限塑令和碳中和相关政策的出台，生物可降解材料PBS和PBAT的需求呈现井喷式发展，从而带动全球市场对BDO需求的快速增长。BDO同时也是合成四氢呋喃、γ
‑
丁内酯等化学品的重要前体。γ
‑
丁内酯(GBL)也是一种重要有机和医药中间体，在医药、农药、石油化工等方面有着广泛的应用，是锂电池电解液主要成分之一，同时也是合成2
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吡咯烷酮、N
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮(NMP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等化学品的重要原料。
[0003]目前，BDO的合成主要是通过化学法，以电石等为原料经过复杂的化学转化过程而合成，是一个极度高能耗的过程，因此开发环境友好、节能降耗的生物法技术，实现从可再生的生物质原料直接发酵生产BDO具有重要的工业应用价值。GBL的生产目前主要是以BDO为原料通过化学法生产，目前未见生物法直接合成GBL的相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种发酵生产γ
‑
丁内酯或1,4
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丁二醇的方法。
[0005]本专利技术构思如下：通过合成生物学技术，以谷氨酸棒杆菌为底盘，通过在该底盘中引入外源的谷氨酸脱羧酶基因gadB*突变体、醇脱氢酶基因yqhD、强化内源或外源的γ
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氨基丁酸转氨酶基因gabT，首次实现了利用重组微生物发酵可再生的原料如葡萄糖、蔗糖等一步发酵生产4
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羟基丁酸，再通过对发酵液简单加热脱水即可以获得GBL。进一步在上述微生物中引入羧酸还原酶CAR基因及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp，即可以实现利用重组微生物直接发酵葡萄糖、蔗糖等生产BDO。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中过表达谷氨酸脱羧酶突变体基因gadB*和醇脱氢酶基因yqhD构建得到的。
[0007]本专利技术中，所述谷氨酸脱羧酶突变体基因gadB*和醇脱氢酶基因yqhD来源于大肠杆菌；基因gadB*和基因yqhD编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
[0008]进一步地，在所述重组谷氨酸棒杆菌中表达内源或外源的γ
‑
氨基丁酸转氨酶基因gabT。
[0009]所述γ
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氨基丁酸转氨酶基因gabT可以来源于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或恶臭假单胞菌，它们编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
[0010]第二方面，本专利技术提供所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产γ
‑
丁内酯中的应用。
[0011]进一步地，利用所述重组谷氨酸棒杆菌，以廉价碳源为原料发酵生产γ
‑
丁内酯。
[0012]所述廉价碳源可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖等中的至少一种。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种谷氨酸棒杆菌工程菌，所述工程菌是在所述重组谷氨酸棒杆菌中表达羧酸还原酶CAR基因及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp构建得到的。
[0014]所述羧酸还原酶CAR基因可以来源于Mycobacterium marinum、Nocardia iowensis、Mycolicibacterium smegmatis或Mycobacteroides abscessus，它们编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示。
[0015]所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp可以来源于枯草芽胞杆菌，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0016]第四方面，本专利技术提供所述谷氨酸棒杆菌工程菌在发酵生产1,4
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丁二醇中的应用。
[0017]进一步地，利用所述谷氨酸棒杆菌工程菌，以廉价碳源为原料发酵生产γ
‑
丁内酯。
[0018]所述廉价碳源可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖等中的至少一种。
[0019]第五方面，本专利技术提供一种谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]第六方面，本专利技术提供所述重组谷氨酸棒杆菌及所述谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，可采用常规的基因工程方法对上述基因进行改造或修饰。
[0021]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0022]本专利技术主要通过合成生物学技术，以谷氨酸棒杆菌为底盘，通过在该底盘中引入外源的谷氨酸脱羧酶基因gadB*突变体、醇脱氢酶基因yqhD、强化内源或外源的γ
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氨基丁酸转氨酶基因gabT，开创性地实现了利用重组微生物发酵可再生的原料如葡萄糖、蔗糖等一步发酵生产4
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羟基丁酸，再通过对发酵液简单加热脱羧即可以获得GBL。进一步在上述微生物中引入羧酸还原酶CAR基因及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp，即可以实现利用重组微生物直接发酵葡萄糖、蔗糖等生产BDO。本专利技术实现了利用可再生原料到重要化学品GBL和BDO的直接发酵生产，生产过程清洁安全，碳排放比化学法降低60％以上，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
[0023]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0024]实施例1生产GBL的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法
[0025]自然界没有微生物能够天然合成GBL。本专利技术通过在谷氨酸棒杆菌中引入谷氨酸脱羧酶gabB*，使得谷氨酸棒杆菌产生的谷氨酸首先被转化为γ
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氨基丁酸，后者在自身或者外源引入的γ
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氨基丁酸转氨酶gabT和外源引入的醇脱氢酶yqhD作用下进一步转化为4
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羟基丁酸，发酵液中的4
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羟基丁酸在酸催化下产生GBL。
[0026]人工合成大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶gabB*的基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中过表达谷氨酸脱羧酶突变体基因gadB*和醇脱氢酶基因yqhD构建得到的；所述谷氨酸脱羧酶突变体基因gadB*和醇脱氢酶基因yqhD来源于大肠杆菌；基因gadB*和基因yqhD编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，进一步在所述重组谷氨酸棒杆菌中表达内源或外源的γ
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氨基丁酸转氨酶基因gabT。3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述γ
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氨基丁酸转氨酶基因gabT来源于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或恶臭假单胞菌，它们编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。4.权利要求1
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3任一项所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产γ
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丁内酯中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以廉价碳源为原料发酵生产γ
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丁内酯；所述廉价碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖中的至少一种。6.谷氨酸棒...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宇，杨令霞，
申请(专利权)人：北京绿色康成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：