一种醇脱氢酶及其在制备度洛西汀关键中间体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于乳酸杆菌(Lactobacillus parafarraginis)的新型醇脱氢酶、重组菌以及其在生物催化制备度洛西汀关键中间体中的应用。所述的醇脱氢酶可不对称还原N,N

【技术实现步骤摘要】
一种醇脱氢酶及其在制备度洛西汀关键中间体中的应用


[0001]本专利技术涉及一种新型醇脱氢酶及应用，特别涉及一种重组醇脱氢酶、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酶或含有该酶的重组细胞为催化剂在制备度洛西汀关键中间体中的应用。

技术介绍

[0002]盐酸度洛西汀(商品名)是美国由礼来公司开发的一种5
‑
羟色胺(5
‑
HT)及去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂，对重度抑郁症、糖尿病周围神经痛、纤维肌痛综合症等均有显著治疗效果(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 13(2003)4477
‑
4480；Journal of Clinical Psychopharmacology 34(2014)9
‑
16)。
[0003]度洛西汀为手性药物，其对映异构体中仅(S)
‑
型具有明显的药理作用，合成(S)
‑
度洛西汀的关键步骤是手性羟基的构建。目前报道的包括γ
‑
氨基醇，γ
‑
氯醇、β
‑
羟基酯和β
‑
羟基腈等在内的手性噻吩醇是引入手性羟基的重要中间体(US8673607B2，US9228213B2，US7790436B2，Bioscience Biotechnology and Biochemistry 68(2004)1481
‑
1488，CN102643879B)，其中又以(S)
‑
N,N
‑
二甲基
‑3‑
羟基
‑3‑
(2
‑
噻吩)
‑1‑
丙胺((S)
‑
DMAA)和(S)
‑
N
‑
甲基
‑3‑
羟基
‑3‑
(2
‑
噻吩)
‑1‑
丙胺((S)
‑
MMAA)最具产业化价值。
[0004]目前合成(S)
‑
DMAA的方法主要有化学法和生物酶法。化学法目前有拆分法和不对称还原法，前者利用(S)
‑
扁桃酸拆分外消旋DMAA获得(S)
‑
DMAA，再将(R)
‑
DMAA进行外消旋实现底物循环利用，但此法反应步骤长，能耗高，收率不到70％。后者利用Li(ent
‑
Chirald)2AlH2、硼烷或金属钌配合物等作为催化剂不对称还原N,N
‑
二甲基
‑3‑
酮
‑3‑
(2
‑
噻吩)
‑1‑
丙胺盐酸盐(DMAK)生成(S)
‑
DMAA，但是选择性差，副产物多，分离困难(Bioorganic Chemistry 65(2016)82
‑
89)。相比之下，生物酶法具有专一性强，反应条件温和，环境友好等优势，主要应用方式是利用羰基还原酶不对称还原DMAK制备(S)
‑
DMAA。专利CN103013898B公开了一种来源于Kluyveromyce marxianus的羰基还原酶，底物浓度3.3g/L，反应48h转化率41.7％，ee值为97.5％；专利CN104830924B公开了一种来源于Chryseobacterium sp.CA49的羰基还原酶ChKRED10，底物浓度1g/L，反应24h转化率39％，ee值>99％；专利CN105803013B公开了一种来源于Candida macedoniensis AKU4588的羰基还原酶CR2，底物浓度1g/L，反应6h转化率92.1％，ee值>99％；专利CN110229796A公开了一种来源于Rhodococcus ruber的酮还原酶RrKRED，底物浓度5
‑
10g/L，反应24h转化率85
‑
95％，ee值>99％，上述专利存在底物浓度低，反应时间长的问题，缺乏工业化生产基础。专利US8673607B2公开了一种来源于Lactobacillus kefiri的酮还原酶及其突变体，底物浓度100g/L，转化率>99％，ee值>99％，但反应工艺需要负压控制以除去副产物丙酮才能有效进行，操作困难，对生物反应器设备要求高，反应时间长，产能低。专利CN105039361B公开了一种来源于Rhodosporidium toruloides的羰基还原酶，底物浓度219g/L，转化率>99％，ee值>99％，但反应工艺中辅酶NADP
+
用量高达0.75mmol/L，辅底物葡萄糖用量高达6mol/L，辅酶原料成本高昂，无法达到产业化要求。
[0005]针对(S)
‑
MMAA的合成报道较少，专利CN110229796A公开了一种来源于Rhodococcus ruber的酮还原酶RrKRED，底物浓度5
‑
10g/L，反应24h转化率95
‑
99％，ee值>99％；专利CN105039361B公开了一种来源于Rhodosporidium toruloides的羰基还原酶，底物浓度50g/L，转化率75％，ee值>99％；专利US9228213B2公开了一种来源于Lactobacillus kefiri的酮还原酶及其突变体，底物浓度146g/L，在反应24h转化率>99％，ee值>99％，但反应工艺需要负压控制，需补加辅底物异丙醇，辅酶NADP
+
和新鲜酶液才能反应完全，工艺控制难度大且对生物反应器设备要求高。
[0006]因此挖掘和筛选催化性能良好的醇脱氢酶工业酶，构建高效且易于控制的催化工艺，对提高度洛西汀酶法工艺产业化水平具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种来源于乳酸杆菌(Lactobacillus parafarraginis)的新型醇脱氢酶，并且能催化DMAK和MMAK不对称还原生成(S)
‑
DMAA和(S)
‑
MMAA，为度洛西汀关键中间体的生物酶法工艺提供工业酶源。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种来源于乳酸杆菌(Lactobacillus parafarraginis)的醇脱氢酶(LpADH)，所述LpADH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]本专利技术所述LpADH通过基因数据库挖掘的方法获得，将所选的LpADH进行全基因合成，构建重组载体和重组大肠杆菌细胞，并验证活力和立体选择性。
[0011]由于氨基酸序列的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醇脱氢酶，其特征在于所述醇脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的同源性。2.一种编码权利要求1所述醇脱氢酶的编码基因。3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，所述基因工程菌包括且不局限于大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等宿主。5.一种由权利要求4所述的重组基因工程菌在制备(S)
‑
N,N
‑
二甲基
‑3‑
羟基
‑3‑
(2
‑
噻吩)
‑1‑
丙胺((S)
‑
DMAA)和(S)
‑
N
‑
甲基
‑3‑
羟基
‑3‑
(2

【专利技术属性】
技术研发人员：沈江伟，阮礼涛，陈茜，顾虹，
申请(专利权)人：上海奥博生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：