一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种L

【技术实现步骤摘要】
al.L
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Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:genetic analyses and application to the stereospecific oxidation of L
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pantoyl lactone.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95:431
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440)。此外，源自星状诺卡氏菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶虽然有较详细地酶学性质研究(Kataoka M,Shimizu S,Yamada H.Purification and characterization of a novel FMN
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dependent enzyme:membrane
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bound L
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(+)
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pantoyl lactone dehydrogenase from Nocardia asteroides.European Journal of Biochemistry,1992,204,799
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806)，但其在大肠杆菌中异源表达差、催化活性差，阻碍了其在生物催化中的进一步应用。目前源自Rhodococcus hoagii的L
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泛解酸内酯脱氢酶已经实现在大肠杆菌中可溶表达，但膜蛋白酶活低仍然限制其在生物催化中的应用。
(三)
技术实现思路

>[0004]本专利技术目的是针对现有L
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泛解酸内酯脱氢酶RhoLPLDH
L254I/V241I
对L
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泛解酸内酯催化活性不高、催化剂(菌体)用量大问题，提供一种L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D
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泛解酸内酯中的应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]一种L
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泛解酸内酯脱氢酶RhoLPLDH突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第156位、第224位、第164位进行单突变或多点联合突变获得。本专利技术所述源自白色红球菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶氨基酸突变体出发序列为SEQ ID NO.1所示，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0007]优选的，所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第156位异亮氨酸突变为亮氨酸；(2)第224位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺；(3)第164位天冬酰胺突变为赖氨酸。
[0008]所述的RhoLPLDH突变体优选为下列之一：(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第156位异亮氨酸突变为亮氨酸(I156L)；(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第224位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺,第164位天冬酰胺突变为赖氨酸且将第156位异亮氨酸突变为亮氨酸(I156L/F224Q/N164K)。
[0009]更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有转氨酶活性的衍生的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白质，均属于本专利技术的保护范围。
[0011]本专利技术还涉及编码所述的L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体的基因。
[0012]优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术还涉及含有所述的L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体编码基因的重组载体和基因工程菌。
[0014]本专利技术还涉及所述L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化L
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泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。催化底物可以是L
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泛解酸内酯，也可以是外消旋D,L
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泛解酸内酯。具体的，所述应用的方法为：以含RhoLPLDH突变体基因和分子伴侣pGro7共表达的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以L
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泛解酸内酯为底物，以pH7.0、50mM的PB缓冲液(0.05M Na2HPO4，0.05M NaH2PO4)为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm(优
选35℃、800rpm)条件下进行反应，用2M NaOH溶液调节pH 7.0～8.0，定期取样检测底物和产物的浓度。
[0015]L
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泛解酸内酯脱氢酶特异性催化L
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泛解酸内酯或者外消旋体中L
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泛解酸内酯脱氢反应见图1所示，生成酮泛解酸内酯。
[0016]本专利技术还涉及所述L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体进一步在微生物催化制备D
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泛解酸内酯中的应用。D
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泛解酸内酯合成路径如图1所示。具体的，所述应用为：采用“双菌一锅法”转化体系，底物加入终浓度500～1000mM，葡萄糖加入终浓度500～1250mM，催化剂用量以菌体湿重计为45g WCW/L/100mM LPL(WCW细胞湿重)，所述细胞催化剂中含RhoLPLDH突变体和分子伴侣pGro7共表达的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与共表达共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以湿重比20：25混合。具体的，所述RhoLPLDH突变体氨基酸序列为SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。所述共轭聚酮还原酶基因(GenBank NO.CCG25060.1)来自正畸念珠菌Candida orthopsilosis，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。所述葡萄糖脱氢酶基因(GenBank NO.KM817194.1)来自Exiguobacterium sibirium DSM 17290，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
[0017]进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含RhoLPLDH突变体载体和分子伴侣pGro7共表达的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，同时添加0.5g/L L
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阿拉伯糖用于诱导分子伴侣蛋白，37℃、180rpm培养2h(OD
600
＝0.4
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0.6)，培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ
‑
D
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thiogalactoside，IPTG)，20℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含RhoLPLDH突变体蛋白和分子伴侣蛋白的湿菌体；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第156位、第224位、第164位进行单点突变或多点联合突变获得。2.如权利要求1所述的L
‑
泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第156位异亮氨酸突变为亮氨酸；(2)第224位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺；(3)第164位天冬酰胺突变为赖氨酸。3.如权利要求1所述的L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.编码权利要求1所述的L
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泛解酸内酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，朱芳莹，张晓健，郑垦，曹敏，杨青，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：