醛酮还原酶突变体及其在6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醛酮还原酶突变体及其在6

【技术实现步骤摘要】
醛酮还原酶突变体及其在6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯合成中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种醛酮还原酶KdAKR突变体、编码基因、工程菌构建及在6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯手性生物合成中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]瑞舒伐他汀、匹伐他汀是第三代全合成“超级他汀”，是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂功效、长期安全性和临床益处。瑞舒伐他汀、匹伐他汀对低密度脂蛋白胆固醇降低作用强，显著降低了心脑血管疾病的发病率和死亡率，是全球降血脂药物重大品种。
[0003]6‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，是瑞舒伐他汀、匹伐他汀的关键合成前体，因此，研究光学纯6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯的高效合成具有重要意义。已有文献报道的化学合成法合成6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯是以(S)
‑4‑
氯
‑3‑
羟基丁酸乙酯与乙酸叔丁酯通过克莱森酯缩合得到6
‑
氯
‑
(5S)
‑
羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯，再经硼氢化钠不对称加氢还原制得。该化学催化工艺存在反应条件苛刻、能耗高、转化率低和立体选择性低等缺陷。生物催化具有优越的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优点，而且反应条件温和、副产物少、环境友好，越来越多应用于手性醇的规模化合成。通常，自然界中的野生型酶对人工合成化合物的催化效率较低，通过分子改造解决酶分子在催化非天然底物时存在的活性较低、稳定性差、底物产物抑制等问题，可以加速工业酶的创制效率，产生经济社会效益。
[0004]醛酮还原酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，含有(α/β)8桶状结构，其催化四联体由酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸和赖氨酸组成，底物谱宽，包括脂肪族和芳香族醛、酮、单糖等。醛酮还原酶通常为约320个氨基酸组成的单亚基蛋白，大小为34～37kDa。
[0005]本专利技术从多布克鲁维酵母Kluyveromyces dobzhanskii中克隆得到一个野生型醛酮还原酶KdAKR
‑
WT，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源过量表达，该酶能够催化6
‑
氯
‑
(5S)
‑
羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯不对称还原成6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯。然而，KdAKR
‑
WT对6
‑
氯
‑
(5S)
‑
羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯的活力较低、立体选择性低，且稳定性较差。我们通过突变体文库构建、工程菌培养、生物催化、产物检测，筛选获得了活性、立体选择性和稳定性均大幅度提高的突变体KdAKR
‑
W297H/Y296W/Y28A/I63L/L58I/G223P(KdAKR
‑
M6)。本专利技术揭示了突变体催化性能提升的分子机制，优化反应工艺参数，构建醛酮还原酶突变体KdAKR
‑
M6催化合成6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯的生物制造工艺。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是针对现有野生型醛酮还原酶KdAKR
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WT对6
‑
氯
‑
(5S)
‑
羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯不对称还原存在立体选择性低、活性不高、稳定性差的问题，提供了一种醛酮还原酶KdAKR突变体、编码基因、工程菌及其不对称还原6
‑
氯
‑
(5S)
‑
羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯制
备6
‑
氯
‑
(3R,5S)
‑
二羟基己酸叔丁酯中的应用，有效提高了醛酮还原酶突变体的立体选择性，催化活性与热稳定性。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种源自多布克鲁维酵母Kluyveromyces dobzhanskii的醛酮还原酶KdAKR突变体，所述醛酮还原酶KdAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第297位、第296位、第28位、第63位、第58位或第223位进行单突变或多突变获得的。
[0009]进一步，优选所述醛酮还原酶KdAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行下列之一突变：(1)第297位色氨酸突变为组氨酸(W297H)；(2)第296位酪氨酸突变为色氨酸(Y296W)；(3)第28位酪氨酸突变为丙氨酸(Y28A)；(4)第63位异亮氨酸突变为亮氨酸(I63L)；(5)第58位亮氨酸突变为异亮氨酸(L58I)；(6)第223位甘氨酸突变为脯氨酸(G223P)；(7)构建第297位色氨酸突变为组氨酸、第296位酪氨酸突变为色氨酸、第28位酪氨酸突变为丙氨酸且第63位异亮氨酸突变为亮氨酸的突变体W297H/Y296W/Y28A/I63L，记为KdAKR
‑
M4(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；(8)构建第297位色氨酸突变为组氨酸、第296位酪氨酸突变为色氨酸、第28位酪氨酸突变为丙氨酸、第63位异亮氨酸突变为亮氨酸、第58位亮氨酸突变为异亮氨酸、第223位甘氨酸突变为脯氨酸的突变体W297H/Y296W/Y28A/I63L/L58I/G223P，记为KdAKR
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M6(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)。
[0010]本专利技术还涉及所述醛酮还原酶KdAKR突变体的编码基因，含编码基因的重组载体以及重组载体构建的工程菌，重组载体选择pET28a(+)、pET28b(+)，工程菌优选以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
[0011]本专利技术还提供一种所述醛酮还原酶KdAKR突变体在不对称还原6
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氯
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(5S)
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羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯制备6
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氯
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(3R,5S)
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二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述应用的方法为：将含醛酮还原酶KdAKR突变体编码基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶KdAKR突变体，其特征在于，所述醛酮还原酶KdAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第297位、第296位、第28位、第63位、第58位或第223位进行单突变或多突变获得的。2.如权利要求1所述醛酮还原酶KdAKR突变体，其特征在于，所述醛酮还原酶KdAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行下列之一突变：(1)第297位色氨酸突变为组氨酸；(2)第296位酪氨酸突变为色氨酸；(3)第28位酪氨酸突变为丙氨酸；(4)第63位异亮氨酸突变为亮氨酸；(5)第58位亮氨酸突变为异亮氨酸；(6)第223位甘氨酸突变为脯氨酸；(7)构建第297位色氨酸突变为组氨酸、第296位酪氨酸突变为色氨酸、第28位酪氨酸突变为丙氨酸且第63位异亮氨酸突变为亮氨酸；(8)第297位色氨酸突变为组氨酸、第296位酪氨酸突变为色氨酸、第28位酪氨酸突变为丙氨酸、第63位异亮氨酸突变为亮氨酸、第58位亮氨酸突变为异亮氨酸、第223位甘氨酸突变为脯氨酸。3.一种权利要求1所述醛酮还原酶KdAKR突变体的编码基因。4.一种含权利要求3所述编码基因的工程菌。5.一种权利要求1所述醛酮还原酶KdAKR突变体在不对称还原6
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氯
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(5S)
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羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯制备6
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氯
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(3R,5S)
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二羟基己酸叔丁酯中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将含醛酮还原酶KdAKR突变体编码基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以6
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氯
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(5S)
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羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～55℃、0～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6
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【专利技术属性】
技术研发人员：王亚军，曹海星，徐沈远，戴晨，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：