一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途制造技术

本申请涉及生物技术领域，具体的，涉及一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途。本申请提供一种甘油磷酸氧化酶（GPO）的突变体，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第426位、第236位、102位或168位的氨基酸被突变成半胱氨酸，形成二硫键使蛋白构象稳定。本发申请提供的甘油磷酸氧化酶的突变体可以有效地提高大肠杆菌中甘油磷酸氧化酶的稳定性，有助于解决GPO在临床应用过程中不稳定而失活的问题。决GPO在临床应用过程中不稳定而失活的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途


[0001]本申请涉及生物
，具体的，涉及一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途。

技术介绍

[0002]甘油磷酸氧化酶(GPO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子的氧化酶，能够催化L
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α
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甘油磷酸酯生成磷酸二羟丙酮，同时释放出H2O2。GPO与脂酶和甘油激酶一起用于临床检测体内甘油三酯的水平，而甘油三脂是临床血脂常规测定指标，甘油三酯增高不仅会形成动脉粥样硬化性心血管疾病，也会引发糖尿病患者微血管并发症，因此受到广泛重视。GPO可作为甘油三脂的关键指标，用于监测心血管等疾病的发展状况。
[0003]GPO存在于多种微生物中，如肠球菌，乳酸杆菌和链霉菌等。目前国内GPO的生产大部分是直接从微生物中提取，但其培养条件复杂，相应的酶的产量也较低，最终导致GPO生产工艺复杂而价格也偏高。因此难以进行规模化的发酵生产。
[0004]大肠杆菌是生物酶制剂生产的常用菌种之一，其特点是：简单的培养条件，清晰的遗传背景，另外还有蛋白表达水平高和发酵技术成熟。基于大肠杆菌系统的这些优点，国内也有部分公司采用大肠杆菌发酵生成GPO的规模化生产，但应用之后发现其稳定性较差，难以满足其在临床上用于对甘油三酯检测的应用。
[0005]因此，目前急需找到一种稳定性较好的GPO，以便满足在临床检测上的需求。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，为解决现有技术中GPO稳定性较差的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途，用于解决现有技术中的问题。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种甘油磷酸氧化酶突变体，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第236位、第426位、第102位和第168位的氨基酸位置上的氨基酸残基中的两项或四项被突变成适于形成二硫键的氨基酸。所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
[0008]所述甘油磷酸氧化酶的突变体与野生型甘油磷酸氧化酶相比，能够提高甘油磷酸氧化酶的稳定性，优选为能够提高大肠杆菌生产的甘油磷酸氧化酶的稳定性。
[0009]所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第236位和第426位的氨基酸位置上的氨基酸残基被替换为半胱氨酸，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第102位和第168位的氨基酸位置上的氨基酸残基被替换为半胱氨酸，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本申请第二方面提供了一种分离的多核苷酸，编码上述的甘油磷酸氧化酶的突变
体，优选的，所述分离的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6其中之一所示的序列。
[0012]本申请第三方面提供了一种构建体，含有上述的分离的多核苷酸。
[0013]本申请第四方面提供了一种宿主，含有上述的构建体或基因中整合有外源的上述的多核苷酸，所述宿主为微生物、细胞或病毒。
[0014]本申请第五方面提供了一种甘油磷酸氧化酶的生产方法，包括适于上述甘油磷酸氧化酶突变体表达的条件下，培养宿主获得所述甘油磷酸氧化酶。
[0015]本申请第六方面提供了一种甘油磷酸氧化酶的的突变体在制备检测产品中的应用，优选的，所述检测产品为甘油三酯检测产品。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0017]1、通过蛋白构象的改变，突变关键氨基酸形成二硫键，从而提高了甘油磷酸氧化酶的突变体的稳定性。
[0018]2、通过将甘油磷酸氧化酶的第236位和第426位突变为半胱氨酸，使其形成二硫键，提高了酶的稳定性，相比野生型酶提高了70％左右。
[0019]3、通过构建油磷酸氧化酶的突变体，使其与辅酶FAD的亲和力增强，改善了原有野生型的GPO其辅酶FAD容易脱落，活性大幅度降低的问题。
附图说明
[0020]图1显示为GPO突变体酶活及稳定性结果示意图。
[0021]图2显示为GPO突变体的37℃处理3天之后剩余酶活百分比结果示意图。
[0022]图3显示为GPO突变体表达电泳图结果示意图。其中，泳道1为GPO
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M102C
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D168C
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上清，泳道2为GPO
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M102C
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D168C
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流穿，泳道3为GPO
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M102C
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D168C
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洗涤，泳道4为GPO
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M102C
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D168C
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洗脱，泳道5为GPO
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V236C
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S426C
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上清，泳道6为GPO
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V236C
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S426C
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流穿，泳道7为GPO
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V236C
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S426C
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洗涤，泳道8为GPO
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V236C
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S426C
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洗脱。
[0023]图4显示为GPO突变体纯化电泳图结果示意图。其中，泳道1是GPO
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WT，泳道2是GPO
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M102C
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D168C，泳道3是GPO
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V236C
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S426C。
具体实施方式
[0024]为了使本专利技术的专利技术目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请专利技术的其他优点及功效。
[0025]本申请的专利技术人经过大量探索研究，意外发现了一种甘油磷酸氧化酶的突变体，上述甘油磷酸氧化酶的突变体与野生型甘油磷酸氧化酶相比，甘油磷酸氧化酶的稳定性提高，且与辅酶FAD的亲和力也增强，从而可以被应用于甘油三脂检测领域，在此基础上完成了本专利技术。
[0026]本申请提供一种甘油磷酸氧化酶突变体，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第236位、第426位、第102位和第168位的氨基酸位置上的氨基酸残基中的两项或四项被突变成适于形成二硫键的氨基酸。所述野
生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
[0027]所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列选自如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第236位、第426位、第102位和第168位的氨基酸残基中的两项或四项被突变成适于形成二硫键的氨基酸；所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。2.如权利要求1所述的甘油磷酸氧化酶的突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶的突变体与野生型甘油磷酸氧化酶相比，能够提高甘油磷酸氧化酶的稳定性，优选为能够提高大肠杆菌生产的甘油磷酸氧化酶的稳定性。3.如权利要求1所述的甘油磷酸氧化酶的突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第236位和第426位的氨基酸残基被替换为适于形成二硫键的氨基酸；和/或，所述甘油磷酸氧化酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列，其第102位和第168位的氨基酸残基被替换为适于形成二硫键的氨基酸。4.如权利要求1所述的甘油...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴赞，朱飞云，吴莹，
申请(专利权)人：上海蓝园生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：