表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3-羟基己酸比例的方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3

【技术实现步骤摘要】
表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3
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羟基己酸比例的方法
[0001]本申请是下述原分案申请的分案申请：申请日为2022年4月6日、申请号为202210751059.9、专利技术名称为“表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3
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羟基己酸比例的方法”；该原分案申请为下述母案申请的分案申请：申请日为2022年4月6日、申请号为2022103534448、专利技术名称为“表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3
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羟基己酸比例的方法”。本申请是申请人按照原分案申请的第一次审查意见通知书中关于单一性问题的审查意见针对原分案申请的再次分案申请。


[0002]本专利技术涉及微生物
，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3
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羟基己酸比例的方法。

技术介绍

[0003]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚合物，具有可再生、可降解的特点且具有多元材料学性能，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。PHA广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。聚羟基丁酸酯(PHB，或P(3HB))是PHA中的一种，是一种由细菌产生的复合生物聚合物，作为一种热塑性塑料，其机械和物理性能可与聚苯乙烯等传统塑料相媲美。然而，由于其高度结晶的性质，P(3HB)比大多数传统塑料更脆和更硬，以至于作为商品塑料的替代品不具有实际应用价值。因此，需要生产包含3HB和更长链单体组合的共聚物，以实现热和物理性能的改进。聚(3
‑
羟基丁酸酯
‑
共
‑3‑
羟基己酸酯)(P(3HB
‑
co
‑
3HHx))是一种混合链长共聚物，较P(3HB)均聚物更柔韧，其中，3HHx(3
‑
羟基己酸)单体部分在很大程度上决定了聚合物的性能。具有较高3HHx摩尔分数(简称H比例)的P(3HB
‑
co
‑
3HHx)共聚物可以表现出类似于低密度聚乙烯(LDPE)等常见商品塑料的特性。因此，提高微生物生产3HB
‑
co
‑
3HHx中3HHx的比例具有重要意义。
[0004]罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，又名Cupriavidus necator)是研究PHA合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于PHB生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，罗氏真养菌可以积累PHB；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，PHB合成会受到影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供能够提高微生物生产PHA中3
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羟基己酸比例的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因，以及用于PHA生产的工程化微生物。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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7任一所示。
[0008]本专利技术通过实验证明，上述基因变体均能够显著提高菌株生产PHA中3
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羟基己酸的比例。
[0009]第二方面，本专利技术提供含有上述基因变体的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，含有以上所述的基因变体的表达盒由启动子、以上所述的基因变体以及终止子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中也可不包含终止子，或者含有增强子等其他转录、翻译调控元件。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，含有以上所述的基因变体的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制性载体和非复制型载体。携带上述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中提供了含有上述基因变体、表达盒或载体的大肠杆菌细胞和罗氏真养菌细胞，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
[0013]第三方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物生产PHA中3
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羟基己酸的比例中的应用，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9
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15任一所示。
[0014]基于上述提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的基因序列，编码同一氨基酸序列的基因序列并不唯一，但所有能够编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的基因均在本专利技术的保护范围内。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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7任一所示。
[0016]上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
[0017]第四方面，本专利技术提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在构建生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的微生物中的应用。
[0018]基于本专利技术提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体能够提高微生物生产PHA中3
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羟基己酸的比例的功能，编码这些变体的基因以及含有这些基因的生物材料可以用于构建生产PHA的菌株。
[0019]上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，将SEQ ID NO.1
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7任一所示的基因导入罗氏真养菌中构建生产PHA的菌株。
[0021]第五方面，本专利技术提供一种工程化罗氏真养菌，所述工程化罗氏真养菌表达所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9
‑
15任一所示。
[0022]本专利技术中，表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体可通过以下任一种或多种方法实现：
[0023](1)导入包含乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的质粒；
[0024](2)在基因组中插入一个或多个拷贝的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，通过在基因组中插入一个拷贝的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因来表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，基因组中插入乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的位置为phaC基因处。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因如SEQ ID NO.1
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7任一所示。这些编码基因的序列为根据罗氏真养菌的密码子偏好性并结合人工优化和筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物生产PHA中3
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羟基己酸的比例中的应用，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微生物为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。4.一种工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。5.根据权利要求4所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述表达通过以下任一种或多种方式实现：(1)导入包含所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的质粒；(2)在基因组中插入一个或多个拷贝的所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因。6.根据权利要求5所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因如SEQ ID NO.3所示。7.根据权利要求4～6任一项所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹进，王禺，李佳佳，侯杰，邹亮，陈子贤，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：