一种利用木糖生产P34HB的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用木糖生产P34HB的菌株及其构建方法和应用。包括如下步骤：S1：体外扩增xylB

【技术实现步骤摘要】
一种利用木糖生产P34HB的菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物合成领域，特别涉及一种利用木糖生产P34HB的菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]白色污染日益侵蚀着地球生态系统，限塑令也在越来越多的国家颁布和实施，可降解材料己经成为人类社会可持续发展必不可少的一部分。聚羟基脂肪酸酯(简称PHA)是一系列可降解环保且生物相容性较好的生物聚酯。PHA是唯一一个完全由微生物合成的天然高分子材料，具有生物可降解性、良好的生物相容性、热塑性等特点。目前已发现超过百种PHA高分子，它们具有各自的特性，其中聚3
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羟基丁酸酯(PHB)是PHA早期最典型的代表，也是最廉价的PHA材料。而近几年出现的3
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羟基丁酸酯和4
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羟基丁酸的共聚酯聚(3
‑
羟基丁酸酯
‑
co
‑4‑
羟基丁酸酯(Poly(3
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hydroxybutyrate
‑
co
‑4‑
hydroxybutyrate，简称P34HB)，是一种崭新的最具前景的PHA高分子材料，其性能可通过调节聚合物中4HB的比例而改变，由于P34HB具有良好的生物相容性能，生物可分解性和塑料的热加工性能，因此可作为生物医用材料、生物可分解包装材料和纺织纤维等。目前，国内已有公司开始工业化生产P34HB这种生物聚酯高分子原料，并对其在可降解塑料和生物医学产品方面进行应用开发和推广。
[0003]生产P34HB的原料主要包括葡萄糖、1,4
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丁二醇和γ
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丁内酯，其中1,4
‑
丁二醇和γ
‑
丁内酯作为合成4HB的前体物质，主要来源于石化基产品，且对微生物具有一定的毒性，市场价格昂贵，不利于P34HB的产业化。利用代谢工程和分子生物学对葡萄糖代谢途径进行改造，其可以利用葡萄糖合成4HB，但4HB得率仍然偏低。
[0004]木质纤维素是作为目前地球上天然可利用，最丰富可再生的绿色资源，不与人类可利用土地形成竞争。木糖作为木质纤维素生物质中第二丰富的糖不能被野生型嗜盐单胞菌摄取利用。目前对木糖合成PHA的研究主要集中在以分子生物学手段构建木糖代谢途径，其代谢产物为PHB，不能合成P34HB，而P3HB和P34HB相比物理性质存在较大差异，应用场景非常有限。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种利用木糖合成P34HB的菌株及其构建方法和应用。本专利技术在MDF
‑
9菌株本身具有合成PHB途径的基础上，利用合成生物学技术加入一条使用木糖作为4HB前体化合物的代谢途径，从而达成生产P34HB的目的。
[0006]本专利技术提供一种合成P34HB的菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0007]S1：体外扩增xylB
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yqhD
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aldD
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orfZ基因序列，将所述xylB
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yqhD
‑
aldD
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orfZ目的基因序列插入第一载体中，得到第一载体质粒；
[0008]S2：体外扩增xylD
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kivD
‑
ppdA
‑
C
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B目的基因序列，将所述xylD
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kivD
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ppdA
‑
C
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B目的基因序列插入第二载体中，得到第二载体质粒；
[0009]S3：将S1得到的第一载体质粒和S2得到的第二载体质粒共同转入Halomonas lutescens MDF
‑
9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。
[0010]所述xylB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述xylD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述kivD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述yqhD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述ppdA
‑
C
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B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述orfZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6，所述aldD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0011]本申请中使用的Halomonas lutescens MDF
‑
9菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC地址:广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO：61850。菌株名称为MDF
‑
9，分类命名为盐单胞菌(Halomonas lutescens)。
[0012]本申请的Halomonas lutescens MDF
‑
9菌株已经在在先申请中公开，申请号为202110929333.2，专利技术名称为“一株盐单胞菌及其应用”。
[0013]进一步的，所述步骤S1中目的基因xylB
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yqhD
‑
aldD
‑
orfZ和所述步骤S2中目的基因xylD
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kivD
‑
ppdA
‑
C
‑
B的扩增体系为：
[0014][0015]进一步的，所述S1中目的基因xylB
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yqhD
‑
aldD
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orfZ和所述步骤S2中目的基因xylD
‑
kivD
‑
ppdA
‑
C
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B的扩增程序为：
[0016][0017]进一步的，所述步骤S1中通过重叠延伸PCR得到xylB
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yqhD
‑
aldD
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orfZ基因片段，将xylB
‑
yqhD
‑
aldD
‑
orfZ基因片段通过双酶切连接插入pRSF
‑
1b载体中，得到所述第一载体质粒。
[0018]进一步的，所述步骤S2中通过重叠延伸PCR得到xylD
‑
kivD
‑
ppdA
‑
C
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B基因片段，将xylD
‑
kivD
‑
ppdA
‑
C
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B基因片段通过双酶切连接插入pET
‑
23a(+)载体中，得到所述第二载体质粒。
[0019]进一步的，所述双酶切的体系为：
[0020][0021]本专利技术还提供一种合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用木糖生产P34HB的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：体外扩增xylB
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orfZ
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aldD
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yqhD目的基因序列，将xylB
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orfZ
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aldD
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yqhD序列插入第一载体中，得到第一载体质粒；S2：体外扩增xylD
‑
kivD
‑
ppdA
‑
C
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B目的基因序列，将xylD
‑
kivD
‑
ppdA
‑
C
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B序列插入第二载体中，得到第二载体质粒；S3：将S1得到的第一载体质粒和S2得到的第二载体质粒共同转入Halomonas lutescens MDF
‑
9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因xylB
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orfZ
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aldD
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yqhD和所述步骤S2中目的基因xylD
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kivD
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ppdA
‑
C
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B的扩增体系为：3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因xylB
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orfZ
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aldD
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yqhD和所述步骤S2中目的基因xylD
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kivD

【专利技术属性】
技术研发人员：沈宏伟，孙磊，吕金艳，张巧巧，叶秀生，余柳松，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：