一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种高产D

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种高产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]D
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泛酸作为辅酶A的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪的代谢，改善毛发色泽并预防疾病。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓、生殖机能发生障碍、适应性降低。D
‑
泛酸钙作为B族维生素，在国内外广泛应用于医药工业，其单方制剂主要适应症为泛酸缺乏症，复合维生素B和多种维生素制剂主要用于补充维生素，而与不同组分配伍的复方制剂适应症更广，如胃肠道疾病、呼吸道疾病、皮肤病、精神不振、神经衰弱等。另外，泛酸钙还用于保健食品。目前国内外很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、“成长快乐”等。
[0003]在已知的D
‑
泛酸合成方法中，工业化生产主要是依赖化学合成法，但其涉及剧毒原料如氢氰酸或氰化钠等的使用，同时存在较为繁琐的光学拆分以及含氰化物的废水污染等问题。
[0004]随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢工程技术的日益发展，微生物发酵法生产D
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泛酸凭借其底物廉价、易分离、毒性小等优势逐渐受到关注。
[0005]有关D
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泛酸的发酵法生产，事实上主要是通过构建泛解酸高产菌株，然后通过外源添加β
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丙氨酸的方式来生产D
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泛酸。如在US6686183专利中，通过对抗缬氨酸菌株FE6进行了一系列改造，去获取D
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泛酸高产量菌株。但仍存在一定的缺陷与问题，例如生物合成途径的复杂性和严格的控制导致发酵过程不稳定、产量不高等问题。
[0006]因此，寻找一种提高D
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泛酸产量的方法、构建一株高产的D
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泛酸菌株仍是一大挑战。

技术实现思路

[0007]为了解决上述提高D
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泛酸产量的技术问题，本专利技术提供了一种高产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。本专利技术提供的高产D
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泛酸的基因工程菌以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为底盘菌，通过敲除ilvA基因同时过表达谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因使得谷氨酸棒状杆菌中的D
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泛酸产量提高，得到的基因工程菌发酵制备D
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泛酸具有较高的效价。
[0008]本专利技术的具体技术方案为：一方面，本专利技术涉及一种高产D
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泛酸的基因工程菌，由以下方法构建而成：(1)将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的ilvA基因敲除，得到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
△
ilvA；(2)使谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA中过表达，即所述高产D
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泛酸的
基因工程菌。
[0009]在菌株的代谢中，不同的代谢途径之间存在非线性的关联，以及辅因子的与主代谢途径的竞争和协作关系。本专利技术提供的高产D
‑
泛酸的基因工程菌，通过在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中敲除ilvA基因以减少消耗丙酮酸生成异亮氨酸，同时过表达泛酸合成途径中3
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甲基
‑2‑
氧桥丁酸羟甲基转移酶基因panB和泛酸合成酶基因panC并异源过表达来自大肠杆菌的泛酸还原酶基因panE使得谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中的D
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泛酸产量进一步提高。
[0010]现有技术如专利US662394和US6787334中，虽然公开了—panBCD的过表达有利于D
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泛酸积累，但其是在抗缬氨酸菌株FE6中进行的一系列改造，同时，对于异源过表达来自大肠杆菌的panE基因可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌的D
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泛酸产量在现有文献中尚未有过报道。本研究团队发现，在谷氨酸棒状杆菌中，基于过表达panBC，并异源过表达来自大肠杆菌的panE基因，敲除ilvA基因可以使D
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泛酸产量进一步提高。
[0011]另一方面，本专利技术还涉及构建高产D
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泛酸的基因工程菌的方法，该方法包括以下步骤：S1：敲除ilvA基因：将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的ilvA基因敲除，得到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA；S2：过表达panB、panC、panE基因：将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA中进行过表达，即所述高产D
‑
泛酸的基因工程菌。
[0012]具体地，所述ilvA基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.1所示。
[0013]具体地，所述panB基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.2所示。
[0014]具体地，所述panC基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.3所示。
[0015]具体地，所述panE基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.4所示。
[0016]具体地，所述ilvA基因敲除的方法为：采用同源重组编辑技术进行敲除。
[0017]作为本专利技术的优选，谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA的构建方法为：以出发菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物ilvA
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1、ilvA
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2及ilvA
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3、ilvA
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4为引物扩增得到ilvA上、下游同源臂片段；对穿梭质粒pK18mobsacB用HindIII、EcoRI 37℃双酶切1h得到线性化的pK18mobsacB；将线性化的pK18mobsacB与上、下游同源臂片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB
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ilvA；将重组质粒电转至电转感受态谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中，利用同源重组编辑技术敲除ilvA基因，构建得到菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA。
[0018]作为本专利技术的优选，将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
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ilvA中的方法为：以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组为模板，用引物pa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于：由以下方法构建而成：(1)将底盘菌谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的ilvA基因敲除，得到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
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ilvA；(2)在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
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ilvA中过表达谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因，即所述高产D
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泛酸的基因工程菌。2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：敲除ilvA基因：将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的ilvA基因敲除，得到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA；S2：过表达panB、panC、panE基因：将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组中的panB、panC基因及大肠杆菌MG1655基因组中的panE基因导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
△
ilvA中进行过表达，即所述高产D
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【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，杨桧，逄爱萍，张博，周俊平，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：