一种高产D-泛酸的益生工程菌及其在产D-泛酸和制备益生菌添加剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产D

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
‑
泛酸的益生工程菌及其在产D
‑
泛酸和制备益生菌添加剂中的应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物技术来源，具体涉及一种高产D
‑
泛酸的益生工程菌及其在产D
‑
泛酸和制备益生菌添加剂中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]D
‑
泛酸(又名维生素B5)，在自然界中主要由微生物和植物合成，是乙酰辅酶A的重要前体物质，同时也是体内脂肪酸合成类固醇所必需的物质，在碳水化合物、蛋白质和脂肪酸的代谢调节中不可缺少。目前在农畜及水产业上，维生素B5及其衍生物被广泛的应用于饲料添加剂中，适当添加维生素B5可以防止家畜生长的迟缓并有利于提高其适应性。同时国内外对维生素B5的生产需求量极大，与传统工业上生产维生素B5的化学法相比，提供一种更加绿色安全的生物方法高效生产维生素B5具有重要价值。
[0003]枯草芽孢杆菌是生物
最重要的菌种之一，属于“公认安全(GRAS)”的生产菌种，可用于食品和药品的发酵生产。作为益生菌，枯草芽胞杆菌在动物肠道内代谢、增殖，可以调节肠道菌群、提高机体消化能力、增强免疫力和抗病力。在工业生产方面，枯草芽孢杆菌因其具有遗传背景清晰、不产生外毒素、无明显密码子偏好性、基因操作便捷等优点，成为构建微生物底盘细胞的理想菌株，适于工业化的大规模生产。
[0004]近年来随基因工程和生物产业的发展，利用具有产生营养物质的益生菌作为饲料产品或者生产菌株逐渐成为重要趋势，然而泛酸这一重要维生素的生物法生产存在需要前体添、产量受限及工程菌益生菌不适于饲料应用等问题。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种高产D
‑
泛酸的益生工程菌及其在产D
‑
泛酸和制备益生菌添加剂中的应用，本专利技术选择枯草芽孢杆菌这一益生菌株作为底盘菌过表达泛酸合成基因，引入UTR
m
进一步增强泛酸合成，同时优化丙酮酸代谢路径，从而实现枯草芽孢杆菌中无前体添加的泛酸合成。此外，将本专利技术构建的益生菌作为饲料成分投喂实现了斑马鱼体重增长。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种高产D
‑
泛酸的益生工程菌，所述益生工程菌以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 23857为底盘菌，将其基因组中panBCD基因簇、alsS基因、ilvD基因、panE2基因、aspB基因的启动子均替换为P43启动子，panBCD基因前UTR序列替换为UTR
m
，敲除pdhA基因或spo0A基因，同时敲除ilvA基因和aspA基因，构建获得所述的益生工程菌，记为B.subtilis MX
‑
3，所述UTR
m
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]优选的，所述panBCD基因簇中panB的GeneID:939032、panC的GeneID:939030、panD的GeneID:939033；alsS的GeneID:936852；ilvA的GeneID:939093；ilvD基因的GeneID:
939084；panE2基因的GeneID:936782；aspB基因的GeneID:939037；pdhA基因的GeneID:936005；spo0A基因的GeneID:938655；aspA基因的GeneID:938721。
[0010]优选的，所述高产D
‑
泛酸的益生工程菌按如下方法构建：
[0011](1)以B.subtilis ATCC 23857为底盘菌株，利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将基因组中的panBCD基因簇的启动子替换为P43启动子，得到重组菌株B.subtilis ATCC23857/P43
‑
panBCD，记为B.subtilis X
‑
1；
[0012](2)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
1基因组中的ilvA基因敲除，得到B.subtilis X
‑
1/ΔilvA，记为B.subtilis X
‑
2；
[0013](3)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
2基因组中的alsS基因和ilvD基因启动子替换为P43启动子，得到B.subtilis X
‑
2/P43
‑
alsS
‑
P43
‑
ilvD，记为B.subtilis X
‑
3；
[0014](4)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
3基因组中的panE2基因启动子替换为P43启动子，得到B.subtilis X
‑
3/P43
‑
panE2，记为B.subtilis MX
‑
1；
[0015](5)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
1基因组中的panBCD基因前UTR序列替换为UTR
m
，得到MX
‑
1/UTR
m
‑
panBCD，记为B.subtilis MX
‑
2；
[0016](6)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
2基因组中的pdhA基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2ΔpdhA；或者将B.subtilis MX
‑
2基因组中的spo0A基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2Δspo0A；
[0017](7)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
2ΔpdhA或B.subtilis MX
‑
2Δspo0A基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2ΔpdhAΔaspA或B.subtilis MX
‑
2Δspo0AΔaspA；
[0018](8)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
2ΔpdhAΔaspA基因组中的aspB基因启动子替换为P43启动子，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2ΔpdhAΔaspA/P43<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产D
‑
泛酸的益生工程菌，其特征在于，所述益生工程菌以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 23857为底盘菌，将其基因组中panBCD基因簇、alsS基因、ilvD基因、panE2基因、aspB基因的启动子均替换为P43启动子，panBCD基因前UTR序列替换为UTR
m
，敲除pdhA基因或spo0A基因，同时敲除ilvA基因和aspA基因，构建获得所述的益生工程菌；所述UTR
m
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述高产D
‑
泛酸的益生工程菌，其特征在于，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述高产D
‑
泛酸的益生工程菌，其特征在于，所述高产D
‑
泛酸的益生工程菌按如下方法构建：(1)以B.subtilis ATCC 23857为底盘菌株，利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将基因组中的panBCD基因簇的启动子替换为P43启动子，得到重组菌株B.subtilis ATCC23857/P43
‑
panBCD，记为B.subtilis X
‑
1；(2)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
1基因组中的ilvA基因敲除，得到B.subtilis X
‑
1/ΔilvA，记为B.subtilis X
‑
2；(3)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
2基因组中的alsS基因和ilvD基因启动子替换为P43启动子，得到B.subtilis X
‑
2/P43
‑
alsS
‑
P43
‑
ilvD，记为B.subtilis X
‑
3；(4)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis X
‑
3基因组中的panE2基因启动子替换为P43启动子，得到B.subtilis X
‑
3/P43
‑
panE2，记为B.subtilis MX
‑
1；(5)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
1基因组中的panBCD基因前UTR序列替换为UTR
m
，得到MX
‑
1/UTR
m
‑
panBCD，记为B.subtilis MX
‑
2；(6)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
2基因组中的pdhA基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2ΔpdhA；或者将B.subtilis MX
‑
2基因组中的spo0A基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
‑
2Δspo0A；(7)利用B.subtilis Cre/loxP基因编辑系统，将B.subtilis MX
‑
2ΔpdhA基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株B.subtilis MX
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，茅呈耀，徐孟涛，原攀红，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：