重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1、菌剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤生物治疗技术领域，公开了一种重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1、菌剂及其应用。所述基因工程菌HCS1为缺失relA基因和spoT基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。基因工程菌HCS1不仅能够正常生长，同时其感染荷瘤小鼠后，能够靶向到肿瘤部位并进行增殖，并显著降低其对机体的毒性。著降低其对机体的毒性。著降低其对机体的毒性。

【技术实现步骤摘要】
重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1、菌剂及其应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤生物治疗
，具体地，涉及重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1、菌剂及其应用。

技术介绍

[0002]现如今，泛指所有恶性肿瘤的癌症，因为其癌细胞具有内源性、异质性和突变抗药性等特性而成为当今生物医学发展领域的重点和难点。癌症成为了21世纪威胁人类生命健康的主要因素之一，因此对于其治疗方法的探索显得愈发重要。
[0003]目前，针对肿瘤的主要治疗方式是传统的手术、放疗及化疗的综合治疗，虽然在一定程度上可以缓解患者的疼痛并使肿瘤体积缩小，但这些方法有着明显的局限性，包括引起肿瘤复发、药物耐受、以及机体的毒副作用。
[0004]近年来，癌症研究人员研发出了一种新型癌症疗法，即细菌介导的肿瘤疗法，用来解决目前临床上传统治疗方式存在的问题。
[0005]肿瘤微环境是指肿瘤存在的细胞环境，其很大程度上决定了肿瘤的生存和发展。由于肿瘤组织中具有不规则脉管系统导致的低氧、免疫抑制和营养丰富等独特的微环境，兼性厌氧菌可以特异性地在此定居、繁殖，从而显示出细菌对肿瘤的高度靶向特异性。因此，细菌介导的癌症治疗的一个显著优势在于细菌能够选择性地在肿瘤部位积聚，其在肿瘤中的浓度可以到达正常组织的一千倍，甚至一万倍以上。目前被广泛研究的细菌包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌等均有显著的抗肿瘤活性。
[0006]在细菌靶向定殖肿瘤的过程中，细菌细胞表面存在的多种病原相关分子模式(Pathogen
‑
associated molecular patterns,PAMPs)，如脂多糖、鞭毛蛋白、核酸等，能够被机体的模式识别受体所识别，从而激活相应的炎症信号通路，募集免疫细胞，引发强烈的炎症反应，并通过进一步激活机体的固有免疫反应与适应性免疫反应将肿瘤细胞杀死。
[0007]然而，由于沙门氏菌长有鞭毛，可以运动，能够通过多种方式逃避宿主的免疫系统，会持续性感染宿主，因此其本身会给机体带来毒性，产生细菌治疗方面的安全性问题。另一方面，对于工程化的细菌在输送某些抗癌药物到达肿瘤部位的时候，如果抵抗宿主胃酸、胆盐的能力受损，会影响其在机体的定殖能力，并且此时对于评估该肿瘤治疗药物的效果会有很大影响。
[0008]减毒的鼠伤寒沙门氏菌是一种兼性厌氧菌，肿瘤组织中有很多缺氧区域，沙门氏菌可以在肿瘤缺氧区域内富集，肿瘤中的菌落数远远大于其它组织中菌落数。尽管在临床前的实验中，减毒沙门氏菌VNP20009有很好的抗肿瘤作用，但是临床一期的研究结果表明VNP20009在人体内抗肿瘤的效果不佳，主要表现为：不能有效在肿瘤组织中富集、抗肿瘤效果不显著。
[0009]因此，有必要构建一种抑制肿瘤效果好且毒力弱化的细菌菌株。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是为了提供一种毒力降低，同时能够减少细菌靶向肿瘤的过程中对机体正常组织的破坏的细菌菌株，进而提高细菌靶向治疗肿瘤的安全性。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1，所述基因工程菌HCS1为缺失relA基因和spoT基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌VNP20009；
[0012]所述relA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述spoT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术的第二方面提供一种菌剂，所述菌剂中含有前述第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1。
[0014]本专利技术的第三方面提供一种前述第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1或前述第二方面中所述的菌剂或其培养上清液在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
[0015]本专利技术的第四方面提供一种前述第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1或前述第二方面中所述的菌剂或其培养上清液在制备用于治疗肠道疾病的药物中的应用。
[0016]本专利技术的第五方面提供一种前述第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1或前述第二方面中所述的菌剂或其培养上清液在制备用于心脑血管疾病的药物中的应用。
[0017]本专利技术的第六方面提供一种前述第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1或前述第二方面中所述的菌剂或其培养上清液在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
[0018]本专利技术的第七方面提供一种表达载体，该表达载体为第一方面中所述的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1。
[0019]本专利技术的第八方面提供一种药物，所述药物中含有活性成分和辅料，所述活性成分中含有前述第二方面中所述的菌剂或其培养上清液。
[0020]本专利技术相对于现有技术至少具有以下优点：
[0021](1)本专利技术以具有高度的肿瘤靶向特异性以及良好的抑癌效果的减毒鼠伤寒沙门氏菌株VNP20009为原始菌株，在其基础上进行基因工程，敲除基因relA和spoT后获得基因工程菌HCS1，基因工程菌HCS1不仅仍能够正常生长，同时其感染荷瘤小鼠后，能够靶向到肿瘤部位并进行增殖，并显著降低其对机体的毒性。
附图说明
[0022]图1是本专利技术提供的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009relA
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的PCR电泳鉴定图；
[0023]图2和图3是本专利技术提供的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1的PCR电泳鉴定图；
[0024]图4是本专利技术提供的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1、对照菌株I和对照菌株II的生长曲线图；
[0025]图5是本专利技术提供的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1与对照菌株II在体外对肿瘤细胞MC38和CT26的入侵结果图。
[0026]图6是本专利技术提供的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1与对照菌株II在体外对肿瘤细胞MC38和CT26的杀伤情况结果图。
[0027]图7是本专利技术提供的注射不同剂量的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1与对照菌株II定殖肿瘤的菌落计数结果图；
[0028]图8是本专利技术提供的注射不同剂量的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1与对照菌株II后荷瘤小鼠的血清转氨酶含量变化结果图；
[0029]图9是本专利技术提供的注射不同剂量的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1与对照菌株II后荷瘤小鼠及其肿瘤的生长曲线图，其中，图9中A为荷瘤小鼠肿瘤体积随时间的变化曲线图，图9中B为荷瘤小鼠体重随时间的变化曲线图，图9中C为荷瘤小鼠随时间的存活率变化图；
[0030]图10是本专利技术提供的重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1/pBAD
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ClyA和对照菌株IIVNP20009/pBAD
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ClyA的蛋白表达检测图。
具体实施方式
[0031]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌HCS1，其特征在于，所述基因工程菌HCS1为缺失relA基因和spoT基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌VNP20009；所述relA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述spoT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌HCS1，其中，所述基因工程菌HCS1由包括以下步骤的方法构建：(1)采用正向引物I
‑
1与反向引物I
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1，以鼠伤寒沙门氏菌株VNP20009基因组为模板，进行PCR扩增，得到relA基因上游同源臂；采用正向引物I
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2与反向引物I
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2，以鼠伤寒沙门氏菌VNP20009基因组为模板，进行PCR扩增，得到relA基因下游同源臂；并采用所述正向引物I
‑
1和所述反向引物I
‑
2，以所述relA基因上游同源臂和所述relA基因下游同源臂为模板，进行PCR扩增，得到所述relA基因上游同源臂和所述relA基因下游同源臂相连的扩增产物I；以及采用正向引物II
‑
1与反向引物II
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1，以鼠伤寒沙门氏菌株VNP20009基因组为模板，进行PCR扩增，得到spoT基因上游同源臂；采用正向引物II
‑
2与反向引物II
‑
2，以鼠伤寒沙门氏菌VNP20009基因组为模板，进行PCR扩增，得到spoT基因下游同源臂；并采用所述正向引物II
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1和所述反向引物II
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2，以所述spoT基因上游同源臂和所述spoT基因下游同源臂为模板，进行PCR扩增，得到所述spoT基因上游同源臂和所述spoT基因下游同源臂相连的扩增产物II；(2)将所述扩增产物I连接到pDM4质粒上，得到pDM4
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relA质粒；以及将所述扩增产物II连接到pDM4质粒上，得到pDM4
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spoT质粒；(3)在接合转移反应条件下，采用转化有所述pDM4
‑
relA质粒的大肠杆菌SM10λpir作为供体菌与作为受体菌的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009进行同源重组I
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1，得到鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
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I；通过sacB基因的反向选择对所述鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
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I进行同源重组I
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2，得到缺失relA基因的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009relA
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；(4)在接合转移反应条件下，采用转化有所述pDM4
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spoT质粒的大肠杆菌SM10λpir作为供体菌与作为受体菌的所述缺失relA基因的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009r...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金海，孙妤婕，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：