一种多酶级联转化富马酸生产D-泛酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种多酶级联转化富马酸生产D

【技术实现步骤摘要】
一种多酶级联转化富马酸生产D
‑
泛酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种多酶级联转化富马酸生产D
‑
泛酸的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]D
‑
泛酸(维生素B5)是活细胞中辅酶A合成的关键前体，也是生命必需的维生素。该化合物可以由微生物和植物合成，但不能由人类和其他动物合成，广泛应用于饲料和食品添加剂行业。此外，D
‑
泛酸还是化妆品和药物中的活性成分，能帮助人体缓和多种抗生素副作用及毒性，减轻过敏症状。因此，D
‑
泛酸作为一种重要精细化学品在医药和其他和工业领域中应用广泛，备受研究者的关注。
[0003]目前，D
‑
泛酸主要通过加热含D
‑
泛酰内酯和β
‑
丙氨酸的甲醇或乙醇的混合物来生产。光学纯底物D
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泛酰内酯通常通过DL
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泛酰内酯的化学或酶促拆分获得，它可以很容易地从异丁醛和甲醛合成，通过醛醇缩合，然后在酸性条件下加入氰化氢和皂化。β
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丙氨酸主要通过丙烯腈或丙烯酸的氨化作用或β
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氨基丙腈的羟基化作用产生。但是这类工艺方法存在原料成本高，工艺条件苛刻，纯化复杂等问题；同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。
[0004]有专利报道以富马酸为底物，以大肠杆菌工程菌为催化剂，高效合成β
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丙氨酸；经全细胞转化合成的β
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丙氨酸再经一系列化学反应，以氧化钙、D
‑
泛酰内酯和甲醇为底物，生成D
‑
泛酸钙。但该技术技术仅通过全细胞实现了富马酸到β
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丙氨酸的转化，要实现到D
‑
泛酸还需要进过复杂的化学反应且需用到甲醇和其他有机试剂，仍存在环境污染问题。
[0005]生物法合成D
‑
泛酸具有成本低、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法包括发酵法和生物转化法。近年来，已经报道了一系列关于D
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泛酸在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中生物合成的研究。以大肠杆菌为宿主，强化D
‑
泛酸生物合成途径，通过引入用于氧化还原调节的群体感应系统和一系列的发酵策略，最终在5L发酵罐中的产量为48.2g/L，但发酵法生产D
‑
泛酸产量水平仍相对较低。生物转化法也取得了一定进展。在大肠杆菌中表达来自谷氨酸棒状杆菌的高活性泛酸合成酶，在发酵的早期对数阶段向含有该酶的大肠杆菌菌株中添加底物(D
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泛解酸和β
‑
丙氨酸)，最终32h产生97.1g/L的D
‑
泛酸，但该D
‑
泛酸合成方法需要通过边发酵边转化且底物D
‑
泛解酸的成本较高，工业化受限。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种高效生产D
‑
泛酸的方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌,实现了低价可再生底物富马酸到D
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泛酸的高效生产。
[0007]本专利技术通过在大肠杆菌细胞中表达合成D
‑
泛酸的路径酶：L
‑
天冬氨酸酶、L
‑
天冬氨酸
‑
α
‑
脱羧酶和泛酸合成酶；通过双质粒表达、表达质粒的启动子和翻译起始区改进和基因复制策略优化三种酶的表达，解决了级联反应协同性差的问题。随后，引入ATP循环再生系统实现了ATP的免添加。最后，通过全细胞催化体系的优化，实现了D
‑
泛酸的高效生产。本
研究为开发大规模生产D
‑
泛酸及相关化合物的生物转化系统提供了借鉴。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种高效生产D
‑
泛酸的重组大肠杆菌，双质粒表达系统表达L
‑
天冬氨酸酶基因CgAspA、L
‑
天冬氨酸
‑
α
‑
脱羧酶基因BsPanD
E56S
、泛酸合成酶基因BbPanC和多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK。
[0009]在一种实施方式中，所述L
‑
天冬氨酸酶基因CgAspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CgAspA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述L
‑
天冬氨酸
‑
α
‑
脱羧酶基因BsPanD
E56S
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BsPanD
E56S
编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述泛酸合成酶基因BbPanC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述BbPanC编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述PaPPK编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0010]在一种实施方式中，以pETDuet
‑
1质粒表达CgAspA、BbPanC和PaPPK基因，以pET
‑
28a(+)质粒表达BsPanD
E56S
基因。
[0011]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
[0013](1)将基因以BbPanC、PaPPK和CgAspA的顺序连接至质粒pETDuet
‑
1上，得到重组质粒1；
[0014](2)将基因BsPanD
E56S
的三个拷贝连接至翻译起始区优化后的质粒pET
‑
28a(+)上，得到重组质粒2；所述翻译起始区优化是以TIR
‑
1替换TIR；所述TIR
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述TIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
[0015](3)将步骤(1)、(2)构建的重组质粒1、2转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种全细胞生产D
‑
泛酸的方法，将所述重组大肠杆菌的湿菌体加入含有富马酸的催化体系中进行反应。
[0017]在一种实施方式中，所述催化体系包括30
‑
40g/L全细胞催化剂、70
‑
80/L富马酸、50
‑
60mM Tris
‑
HCl、10
‑
15mMAMP、100
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120mM六偏磷酸钠和600
‑
700mM D
‑
泛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，过表达L
‑
天冬氨酸酶基因CgAspA、L
‑
天冬氨酸
‑
α
‑
脱羧酶基因BsPanD
E56S
、泛酸合成酶基因BbPanC和多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述L
‑
天冬氨酸酶基因CgAspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述L
‑
天冬氨酸
‑
α
‑
脱羧酶基因BsPanD
E56S
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述泛酸合成酶基因BbPanC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pETDuet
‑
1质粒表达CgAspA、BbPanC和PaPPK基因，以pET
‑
28a(+)质粒表达BsPanD
E56S
基因。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为EscherichiacoliBL21(DE3)。5.构建权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将基因以BbPanC、PaPPK和CgAspA的顺序连接至质粒pETDuet
‑
1上，得到重组质粒1；(2)将三个拷贝的基因BsPanD
E56S
连接至翻译起...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，许媛怡，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：