牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用，牛蛙皮肤活性肽是从构建的牛蛙皮肤ｃＤＮＡ文库中筛选到的，牛蛙皮肤活性肽基因编码的一种单链多肽。分子量为３１４４．８道尔顿，等电点为１０．１６，多肽全序列一级结构为：Ｍｅｔ？Ｍｅｔ？Ａｒｇ？Ｖａｌ？Ｍｅｔ？Ａｒｇ？Ａｒｇ？Ｌｙｓ？Ｔｈｒ？Ｌｙｓ？Ｖａｌ？ＩＩｅ？ＴｒｐＧｌｕ？Ａｒｇ？Ａｒｇ？Ａｓｐ？Ｐｈｅ？ＩＩｅ？Ｇｌｙ？Ｌｅｕ？Ｔｙｒ？Ｓｅｒ？ＩＩｅ？Ａｓｐ（ＭＭＲＶＭＲＲＫＴＫＶＩＷＥＫＫＤＦＩＧＬＹＳＩＤ）。编码牛蛙皮肤活性肽的基因由３６９个核苷酸组成，其中编码牛蛙皮肤活性肽的为第９７－１７１位核苷酸。人工合成的牛蛙活性肽具有明显的抑制细菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用，还具有清除自由基的功能。本发明专利技术的牛蛙皮肤活性肽具有分子量小、合成简单、抗菌活性强、抗氧化等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。
技术介绍
自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器，但是由于人类对〃 抗生素〃 的持续使用和滥用，导致很多细菌对现有的抗生素都产生了耐药性，所以寻找全新的机制杀伤病原微生物，且不易形成耐药性的新型抗生素已经成为目前研究的热点之一。两栖类动物皮肤多肽类不仅具有高效、广谱且不易产生耐药性等特点，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，已成为人们应对日趋严重的耐药性细菌的新型生物制剂的主要生物资源。相关研究结果显示，两栖类皮肤多肽目录呈现出超乎想象的分子和功能多样性。蛙科(Ranidae)是分布最广泛的两栖动物，几乎遍及各大洲，占据着不同的生态地位，为适应特定环境，它们皮肤的活性成分在种类和数量等方面，都是极其惊人的。 在中国，很多两栖类动物被作为传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床治疗。例如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具光谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床。 目前我国科学家研究发现滇蛙皮肤具有极强的氧化自由基清除能力，并从滇蛙皮肤分泌液中发现了 11个家族的抗氧化多肽。这些抗氧化多肽是由15 30个氨基酸组成的小肽。这些蛙类抗氧化多肽快速、强大的自由基清除能力可以最大限度地保护蛙类皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤，是皮肤保护、皮肤抗氧化领域的重大发现，对生物医学、抗氧化保护以及化妆品研发具有重要意义。牛蛙，原产于北美洲，1959年从古巴、日本引进我国内陆。目前我国主要靠养殖生产，全国各地均产，主要集中于湖北、湖南、江西、新疆、四川等地。 专利技术人将本专利技术的牛蛙皮肤活性肽氨基酸结构经蛋白质数据库进行比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的牛蛙皮肤活性肽编码基因经数据库进行比较，与其它已发现的活性肽基因的同源性比较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛蛙皮肤活性肽及其基因，为新的活性肽，具有广谱抗细菌功效。 本专利技术还公开了牛蛙皮肤活性肽及其基因在作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。3用。为本专利技术进一步公开了牛蛙皮肤活性肽及其基因在在制备抗氧化保护药物中的应本专利技术的牛蛙活性肽基因，其cDNA由369个核苷酸组成，其自5'端至3'端序列atgttcaccatgaagaaatcgctgttactcctttttttccttgggaccatcaacttatct 60ttttgtg^^ggagag^gag^agaggg^acggatgatgagggtgatgaggagg^g 1203cte^gttetttggg^^3^gg3ctttettgg3ttetec3gtettgattg^ctggc 180cctgaacacccaaaaagagccaaagagtcgttactgtgacattcctacagccaataaacc 300ctectgg^gcttecatcgtggtttetegtteagtctg^^^^^^^^^^^ 360■■■■a 369。本专利技术的牛蛙活性肽，其分子量为3144.8道尔顿，等电点为10. 16 ;编码牛蛙皮肤活性肽的为97-171位核苷酸，其氨基酸序列为 Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Trp Glu Arg Arg Asp Phelie Gly LeuTyr Ser lie Asp。本专利技术牛蛙皮肤活性肽的制备过程，包括以下步骤 1)牛蛙皮肤活性肽基因的克隆 牛蛙皮肤总RNA的提取，mRNA的纯化，cDNA第一链的合成及cDNA文库构建，设计引物利用PCR方法筛选牛蛙皮肤活性肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，上游引物为5 ' -ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3 '，下游引物为CLONTECH公司SMART cDNA LibraryConstruction Kit中的3' PCR Primer引物，其序列为5' -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。所获阳性克隆进行核苷酸序列测定。基因测序结果表明牛蛙皮肤活性肽的基因由369个核苷酸组成，其自5'端至3'端序列为 atgttcaccatgaagaaatcgctgttactcctttttttccttgggaccatcaacttatct 60 ttttgtg^^ggagag^gag^agaggg^acggatgatgagggtgatgaggagg^g 120 actaaagttatttgggaaaaaaaggactttattggattatacagtattgattgaactggc 180 tccattcgtggaatattgaaaaacaggctacaaattgtaacaatgaaaacaagccctatc 240 cctgaacacccaaaaagagccaaagagtcgttactgtgacattcctacagccaataaacc 300 ctectgg^gcttecatcgtggtttetegtteagtctg^^^^^^^^^^^ 360 ■■■■a 369 编码牛蛙皮肤活性肽的为97-171位核苷酸，其氨基酸序列为 Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Trp Glu Arg Arg Asp Phelie Gly LeuTyr Ser lie Asp。 牛蛙皮肤活性肽基因作为基因工程制备牛蛙皮肤活性肽的应用。 牛蛙皮肤活性肽的制备方法 根据编码牛蛙皮肤活性肽的基因推导出牛蛙皮肤活性肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪APEX396合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。分子量测定采用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)，发射电压为4. 5Kv。纯化的牛蛙凝集素用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度(流速1. OmL/min ;流动相乙腈+水+TFA0. 01 % ，梯度洗脱；色谱柱C18，检测波长220nm)，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。 以下试验例表明牛蛙皮肤活性肽的医学作用 1.牛蛙皮肤活性肽抑制细菌生长的作用 抗菌活性检测，测定最小抑菌浓度(MIC)时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。以LB液体培养基作为培养介质。将过夜培养的标准菌株用LB培养基稀释菌落成每毫升含105细菌的菌液，将菌液接种于LB液体培养基，细菌最终浓度为105。 在96孔细胞培养板上加入90 ii L LB培养基中，加入经0. 22 y m孔径膜过滤的溶解于生理盐水的牛蛙活性肽样品10 L作为第一孔，混匀后取50 L加入第2管，依次倍比稀释，自第9孔吸出50 L弃去，第10管系对照管，每个样品重复两次。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛蛙活性肽基因，其特征在于：ｃＤＮＡ由３６９个核苷酸组成，其自５′端至３′端序列为：　　ａｔｇｔｔｃａｃｃａｔｇａａｇａａａｔｃｇｃｔｇｔｔａｃｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｃｔｔｇｇｇａｃｃａｔｃａａｃｔｔａｔｃｔ　６０　　ｔｔｔｔｇｔｇａａａａｇｇａｇａｇａａｇａｇａａａｇａｇｇｇａａａｃｇｇａｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇａｔｇａｇｇａｇｇａａｇ　１２０　　ａｃｔａａａｇｔｔａｔｔｔｇｇｇａａａａａａａｇｇａｃｔｔｔａｔｔｇｇａｔｔａｔａｃａｇｔａｔｔｇａｔｔｇａａｃｔｇｇｃ　１８０　　ｔｃｃａｔｔｃｇｔｇｇａａｔａｔｔｇａａａａａｃａｇｇｃｔａｃａａａｔｔｇｔａａｃａａｔｇａａａａｃａａｇｃｃｃｔａｔｃ　２４０　　ｃｃｔｇａａｃａｃｃｃａａａａａｇａｇｃｃａａａｇａｇｔｃｇｔｔａｃｔｇｔｇａｃａｔｔｃｃｔａｃａｇｃｃａａｔａａａｃｃ　３００　　ｃｔａｃｔｇｇａａｇｃｔｔａｃａｔｃｇｔｇｇｔｔｔａｔａｇｔｔａａｇｔｃｔｇａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ　３６０　　ａａａａａａａａａ　３６９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文瑜，韩俊友，赵瑞利，雷连成，冯新，孙长江，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]