与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198及其应用。lnc46198序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术发现，lnc46198在胚胎期半番鸭性腺中特异性表达，并抑制鸭胚成纤维细胞增殖，促进鸭胚成纤维细胞凋亡。表明lnc46198可能通过抑制细胞增殖活力而影响胚胎期半番鸭性腺发育，为关键lncRNA在半番鸭生殖细胞分化发育等胚胎期性腺分化发育过程中的功能奠定基础，为半番鸭不育性状的发生机制提供科学参考依据。发生机制提供科学参考依据。

【技术实现步骤摘要】
与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198及其应用。

技术介绍

[0002]半番鸭生产是福建肉鸭生产的优势特色产业。半番鸭杂种优势很强，兼具父母本优点，颇具发展潜力。然而，半番鸭生产仍存在一个严重问题，即半番鸭没有实际种用价值，要获得半番鸭苗必须饲养其亲本并借助人工授精技术，生产成本增加，极大限制了半番鸭产业发展。与繁殖性能正常的父母本北京鸭或番鸭相比，半番鸭生殖系统不完整，多表现性腺发育缺陷，从而直接导致半番鸭繁殖力低下，但半番鸭不育的原因及与影响半番鸭性腺发育缺陷的调控机制尚不清楚。本研究拟探究半番鸭及其亲本性成熟期、胚胎期性腺发育关键转录本lnc46198在半番鸭性腺发育及细胞分化等过程中的功能，以期后期通过敲除等基因编辑技术、外源性注射或嵌合体等手段促使半番鸭性腺发育正常，进而探索半番鸭种用的可能性，为半番鸭种质可控技术提供科学依据。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198及其应用。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]一种用于检测长链非编码RNA分子lnc46198表达水平的引物对，其序列为：F：5
>’‑
CGGCTGATTCCGTTATGGGTAT
‑3’
，R：5
’‑
CAGGGCTTCCTCCACCTTT
‑3’
；或F2：5
’‑
CAAATCTAGGCAACACCACA
‑3’
，R2：5
’‑
CAGCAACAATCATAGGAGGC
‑3’
。
[0006]含有长链非编码RNA分子lnc46198的重组质粒lnc46198
‑
pcDNA3.1。
[0007]长链非编码RNA分子lnc46198在制备调控胚胎期半番鸭性腺发育的产品中的应用。
[0008]一种抑制鸭胚成纤维细胞增殖、促进鸭胚成纤维细胞凋亡的方法，其是过表达权利要求1所述的长链非编码RNA分子lnc46198。
[0009]进一步的，应用重组质粒lnc46198
‑
pcDNA3.1实现过表达长链非编码RNA分子lnc46198。
[0010]一种调控鸭胚成纤维细胞增殖及细胞凋亡的产品，包括用于过表达长链非编码
Magna RIP Kit（Millipore）说明书进行。通过2
‑
ΔΔCt
法定量分析lnc46198与17β
‑
HSD3表达。其中，17β
‑
HSD3
‑
pcDNA3.1
‑
Flag过表达质粒的构建具体如下：提取半番鸭雄性性腺组织总RNA，逆转录为cDNA作为模板，利用引物17β
‑
HSD3
‑
F和17β
‑
HSD3
‑
R进行PCR扩增。PCR扩增反应体总体积50μL：去离子水1.0μL，17β
‑
HSD3
‑
F（10μmol/L）1.0μL，17β
‑
HSD3
‑
R（10μmol/L）1.0μL，cDNA 2.0μL，Platinμm
®ꢀ
PCR SμperMix, High Fidelity 45μL；PCR扩增反应条件：预变性94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 1 min，35个循环。PCR扩增产物采用QIAqμick PCR&Gel Cleanμp Kit进行切胶回收（具体参照试剂盒说明书）。用内切酶BamHI和EcoRI对获得的PCR产物进行双酶切，随后对酶切产物进行纯化回收。用内切酶BamHI和EcoRI对pcDNA3.1质粒（购自美国Thermo Fisher）进行双酶切。利用GeneArt
®ꢀ
Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix将双酶切后的pcDNA3.1质粒与PCR片段进行连接，得到17β
‑
HSD3
‑
pcDNA3.1
‑
Flag过表达质粒，转化至DH5α感受态细胞。其中，17β
‑
HSD3
‑
F和17β
‑
HSD3
‑
R序列如下：17β
‑
HSD3
‑
F：5
’‑
TTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGCATGCTAGCTTGCTGCCTT
‑3’
，17β
‑
HSD3
‑
R：5
’‑
CTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCGGGCTTCCTCCACCTTTTCT
‑3’
。
[0027]结果显示（图1），与IgG组相比，17β
‑
HSD3
‑
pcDNA3.1
‑
Flag过表达质粒组lnc46198表达水平富集了71.51倍，表明lnc46198与17β
‑
HSD3蛋白存在着直接或间接的相互作用，且以17β
‑
HSD3抗体蛋白孵育后能够沉淀得到lnc46198，表明二者可能存在靶向关系。
[0028]实施例2：qPCR技术测定lnc46198特异性表达12.5胚龄时收集半番鸭鸭胚，在体视显微镜下采集大脑、心脏、肝脏、肺脏、肌肉、肾脏和雄性性腺，同时采集半番鸭E10、E15、E20和E25不同胚龄时期的雄性性腺组织。提取总RNA，逆转录实验后cDNA贮存在
‑
20℃备用。利用qPCR技术测定半番鸭不同组织和不同胚龄时期lnc4619相对表达量。根据lnc46198测序序列，以GAPDH为内参基因，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计定量PCR引物，由上海生工合成。PCR反应体系：Power SYBR
®ꢀ
Green Master Mix 10.0μL，cDNA 1.0μL，SDW 8.0μL，正向引物(10μmol/L) 0.5μL，反向引物(10μmol/L) 0.5μL。PCR反应条件：95℃ 1min；95℃ 15s，63℃ 25s，40个循环。每个样品重复3次，相对表达水平以2
‑
ΔΔCt
进行统计分析。其中，引物序列如下：GAPDH
‑
F：5<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与胚胎期半番鸭性腺发育相关的长链非编码RNA分子lnc46198，其特征在于：碱基序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种用于检测权利要求1所述长链非编码RNA分子lnc46198表达水平的引物对，其特征在于：序列为：F1：5
’‑
CGGCTGATTCCGTTATGGGTAT
‑3’
，R1：5
’‑
CAGGGCTTCCTCCACCTTT
‑3’
；或F2：5
’‑
CAAATCTAGGCAACACCACA
‑3’
，R2：5
’‑
CAGCAACAATCATAGGAGGC
‑3’

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽，章琳俐，辛清武，缪中纬，朱志明，郝晓娜，郑嫩珠，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：