一种凡纳滨对虾钠钾ATPasealpha基因的dsRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha(PvATP1A)基因的dsRNA，序列如SEQ ID NO：1所示。首先获得凡纳滨对虾ATP1A基因，选择序列为SEQ ID NO：1的基因片段，用于dsRNA的合成。随后将合成的dsRNA注射到对虾体内，干扰成功后注射WSSV。与对照组相比，干扰组病毒拷贝数和病毒基因(IE1和VP28)表达下降以及对虾存活率上升，表明ATP1A有助于WSSV增殖。进一步通过免疫荧光分析ATP1A影响WSSV增殖的机制，发现ATP1A与WSSV共定位，并且干扰ATP1A后WSSV入胞减少。本发明专利技术的PvATP1A基因的dsRNA为WSSV的防治提供了一种潜在的药物，其可显著抑制WSSV入胞，进而高效抑制WSSV的复制。本发明专利技术的PvATP1A基因的dsRNA分子质量小易降解，不会破坏养殖过程中的生态平衡，是一种既环保又高效的病毒防御物质。的病毒防御物质。的病毒防御物质。

【技术实现步骤摘要】
一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及水产养殖的病毒性疾病防治领域，尤其涉及一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因(简称PvATP1A)的dsRNA在抗白斑综合症病毒中的应用。

技术介绍

[0002]凡纳滨对虾(又称南美白对虾)由于其营养要求低、生长快、适应性强，出肉率高等优点，目前已发展成为我国对虾养殖产量最高的虾类。据统计数据显示，2021年我国凡纳滨对虾养殖总产量高达197万吨，占全年对虾养殖总产量的80％以上。然而，长期以来我国对虾养殖业中的病害问题十分严重，导致对虾养殖成活率不高。其中，由白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)引起的白斑综合症对我国对虾养殖的影响最为严重。WSSV是一种具有囊膜、无包涵体的杆状双链环状DNA病毒，其是线形病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)的唯一成员，具有宿主范围广、传染性强和致死率高等特点。
[0003]病毒是一种严格的细胞内寄生的生物，其生命周期大致包括三个阶段：进入宿主细胞、基因组复制以及病毒粒子组装与释放。其中，病毒进入宿主细胞是决定其是否成功感染的关键环节之一。学者们认为，如果能够抑制病毒入胞，则可以从源头抑制病毒感染，从而有效提高宿主的存活率。然而，目前关于抑制/阻断WSSV入胞的药物报道较少。目前防治WSSV的主要措施是在养殖环境中添加广谱性的抗生素，此法在一定程度可以抑制病原菌的侵害，但是作用时间短，容易残留在在自然环境中，最终在人体内积累，损害人的身体健康。大部分已报道的WSSV防治药物如蛋白/多肽、miRNA以及中草药制剂等都是通过直接杀伤病毒、抑制病毒复制和提高对虾免疫能力等作用机制发挥作用，例如用香豆素类衍生物和中草药抗病免疫饲料添加剂等作为免疫增强剂，但这些免疫增强剂所需材料繁多，且制作过程繁琐。
[0004]因此，积极寻找和开发抑制/阻断病毒入胞的药物，能够大大降低防治WSSV的难度，达到高效环保的防治WSSV的目的，对解决我国对虾养殖中白斑综合症病害问题具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种凡纳滨对虾ATP1A基因的dsRNA及其在抗白斑综合症病毒中的应用。本专利技术PvATP1A基因的dsRNA可有效地抑制WSSV入胞从而抑制WSSV在凡纳滨对虾体内的增殖，提高对虾存活率，以解决凡纳滨对虾感染WSSV而致死的问题。
[0006]一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA，序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA及其在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用。首先获得凡纳滨对虾ATP1A基因，经研究发现，利用dsRNA在体内被酶分解成siRNA，可以达到敲降基因的目的。使用DNAMAN软件对ATP1A出现siRNA多的区域进行预测，发现数量最多的是SEQ ID NO：1的基因片段，因此选择序列为SEQ ID NO：1的基因片段用于dsRNA的合成。将合成的dsRNA注射到对虾体内，干扰成功的基础上注射WSSV。与对照组相
比，干扰组病毒拷贝数及病毒基因(IE1和VP28)表达下降以及对虾存活率上升，表明ATP1A有助于WSSV增殖。进一步通过免疫荧光分析ATP1A影响WSSV增殖的机制，发现ATP1A与WSSV共定位，并且干扰ATP1A后WSSV入胞减少。本专利技术的PvATP1A基因的dsRNA为白斑综合症病毒的防治提供了一种潜在的药物，可显著抑制WSSV入胞，进而高效抑制WSSV的复制。本专利技术的PvATP1A基因的dsRNA分子质量小易降解，不会破坏海洋养殖过程中的生态平衡，是一种既环保又高效的病毒防御物质。
[0008]本专利技术还提供一种上述dsRNA的表达盒。
[0009]本专利技术还提供一种上述dsRNA的重组菌。
[0010]本专利技术还提供一种上述dsRNA的重组载体。
[0011]本专利技术还提供上述凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA或重组载体在制备抑制WSSV的制剂中的用途。
[0012]本专利技术还提供一种含有上述凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA、重组载体中的一种或者多种混合的制剂。
[0013]优选的，所述制剂包括生物抑制剂、试剂盒、饲料添加剂中的一种或多种。
[0014]优选的，所述制剂可用于凡纳滨对虾。
[0015]优选的，所述制剂可抑制WSSV增殖。
[0016]优选的，所述制剂可降低WSSV感染导致的凡纳滨对虾的死亡。
[0017]本专利技术的凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA可以采用本领域技术人员已知的方法合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行原核表达和纯化。
[0018]与现有技术相比，本专利技术采用RNA干扰技术对PvATP1A在WSSV感染中的功能与作用机制进行探究。干扰PvATP1A后WSSV攻毒，发现与对照组相比，血细胞中病毒拷贝数及病毒基因(IE1和VP28)表达下降，且对虾存活率上升，表明PvATP1A基因的dsRNA抑制WSSV增殖。进一步通过免疫荧光实验探索PvATP1A影响WSSV增殖的机制。结果发现，PvATP1A与WSSV共定位，并且干扰PvATP1A后WSSV内化受到抑制，表明PvATP1A参与WSSV入胞过程。因此PvATP1A基因的dsRNA可作为抗WSSV的新药物，应用于WSSV的防治工作中。
附图说明
[0019]图1为干扰PvATP1A对WSSV增殖的影响分析；其中：A为PvATP1A mRNA水平干扰效果分析；B为PvATP1A蛋白水平干扰效果分析；C为PvATP1A干扰前后IE1 mRNA水平表达分析；D为PvATP1A干扰前后VP28 mRNA水平表达分析；E为PvATP1A干扰前后WSSV拷贝数分析；F为PvATP1A干扰前后，IE1、VP28蛋白水平表达分析。
[0020]图2为干扰PvATP1A后WSSV攻毒，对虾存活率分析。
[0021]图3为PvATP1A与WSSV共定位分析；其中：A为荧光显微镜观察PvATP1A与WSSV共定位情况(箭头为WSSV与PvATP1A共定位区域)；B为共定位率统计。
[0022]图4为干扰PvATP1A对WSSV入胞影响分析；其中：A为荧光显微镜观察PvATP1A干扰前后WSSV内化情况分析(箭头为WSSV病毒粒子)；B为WSSV病毒粒子的内化率统计。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一
步地详细描述。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本专利技术保护范围的限制，任何在本专利技术基础上做出的改变和变化，都在本专利技术的保护范围之内。
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法
[0025]实施例1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA，其特征在于，序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种含有根据权利要求1所述dsRNA的表达盒。3.一种含有根据权利要求1所述dsRNA的重组菌。4.一种含有根据权利要求1所述dsRNA的重组载体。5.根据权利要求1所述凡纳滨对虾钠钾ATPase alpha基因的dsRNA、或权利要求4所述重组载体在制备抑制WSSV的制剂中的用途。6.一种含有根据权利要求1所述凡纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚德福，张慧敏，章跃陵，朱景花，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：