一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA及其制备方法和应用，属于生物技术领域，所述dsRNA是由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为正义RNA和其反向互补序列作为反义RNA组成的双链RNA。本发明专利技术首次提供了一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA，通过注射方式将该dsRNA片段注射进入朱砂叶螨2～3日龄雌成螨体内，对靶标CPR基因的沉默效果佳；以及在实现CPR基因沉默后，能够显著增强如哒螨灵等杀螨剂对朱砂叶螨的杀螨效果。同时，本发明专利技术提供的dsRNA靶向性高、制备成本低廉，实用性强。实用性强。实用性强。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]以朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)为代表的害螨是我国重要的农业有害生物，可以危害蔬菜、棉花、果树等多种经济作物，造成了严重的经济损失。农业害螨的防治多年来一直以施用化学农药为主，但是由于其具有世代周期短，繁殖能力强，孤雌生殖等特点，导致其抗药性发展十分迅速，目前已成为抗性问题最为突出的节肢动物之一。加之，现有多数杀螨剂在害螨与非靶标生物间选择性低，田间使用杀螨剂抑制了包括捕食螨在内的非靶标生物种群发展、甚至导致种群崩溃，使害螨田间再猖獗问题日益严重。此外，随着人们对食品安全、农药残留等问题的关注度日益增高，研发新型农业害螨防治技术的需求也愈发迫切。因此，研发创制具有优异杀螨活性且对环境友好，对非靶标生物安全的绿色控螨方法是螨类防控的当务之急。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA及其制备方法和应用，通过注射方式将该dsRNA片段注射进入朱砂叶螨2～3日龄雌成螨体内，对靶标CPR基因的沉默效果佳；以及在实现CPR基因沉默后，能够显著增强如哒螨灵等杀螨剂对朱砂叶螨的杀螨效果。
[0004]第一方面，本申请实施例提供了一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA，所述dsRNA是由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为正义RNA和其反向互补序列作为反义RNA组成的双链RNA。
[0005]第二方面，本申请实施例提供了第一方面所述的靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA的制备方法所述制备方法包括：
[0006]得到朱砂叶螨总RNA；
[0007]将所述朱砂叶螨总RNA中的基因组DNA进行去除，后进行反转录，得到cDNA；
[0008]采用全长克隆引物对所述cDNA进行PCR基因克隆，得到RNAi
–
CPR引物对；
[0009]提取CPR质粒；
[0010]以所述CPR质粒和所述RNAi
–
CPR引物对进行RNAi片段的合成，得到扩增产物；
[0011]回收所述扩增产物，并进行dsRNA的合成与纯化，得到dsRNA。
[0012]进一步地，所述得到朱砂叶螨总RNA的方式包括采用RNA提取试剂盒或Trizol法提取朱砂叶螨总RNA。
[0013]进一步地，将所述朱砂叶螨总RNA中的基因组DNA进行去除，后进行反转录，得到cDNA的步骤：
[0014]采用RQ1 RNase
‑
Free DNase试剂盒将所述朱砂叶螨总RNA中的基因组DNA进行去
除，后采用Prime Script
TM RT reagent Kit DRR037A试剂盒进行反转录，得到cDNA。
[0015]第三方面，本申请实施例提供了第一方面所述的靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA在以下至少一种上的应用：
[0016]1)防治朱砂叶螨或制备防治朱砂叶螨的产品；
[0017]2)促进朱砂叶螨死亡或制备促进朱砂叶螨死亡的产品；
[0018]3)抑制朱砂叶螨生长或制备抑制朱砂叶螨生长的产品；
[0019]4)抑制朱砂叶螨体CPR基因的表达或制备抑制朱砂叶螨体CPR基因表达的产品。
[0020]第四方面，本申请实施例提供了一种防治朱砂叶螨的组合物，所述组合物包括：
[0021](i)第一方面所述的靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA；以及
[0022](ii)杀螨剂。
[0023]进一步地，所述杀螨剂包括哒螨灵、虫螨腈、乙螨唑、炔螨特、阿维菌素、联苯肼酯、丁氟螨酯、乙唑螨腈和螺螨酯中的至少一种。
[0024]相较于现有技术，本申请实施例提供的上述方案至少具有以下有益效果：
[0025]本申请实施例首次提供了一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA，通过注射方式将该dsRNA片段注射进入朱砂叶螨2～3日龄雌成螨体内，对靶标CPR基因的沉默效果佳；以及在实现CPR基因沉默后，能够显著增强如哒螨灵等杀螨剂对朱砂叶螨的杀螨效果。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0027]图1为本专利技术实施例中荧光定量PCR测定结果图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0029]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本专利技术。
[0030]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供试剂盒上所述操作方法进行。
[0031]实施例
[0032]本实施例的目的在于提供一种靶向朱砂叶螨CRP基因的dsRNA片段设计及其制备方法与应用，可实现对CPR基因的特异性沉默，并对哒螨灵药剂实现增效效果。
[0033]1.本专利技术所提供的dsRNA片段包含T7启动子序列+CPR基因保守序列区+T7启动子序列，所述dsRNA是由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为正义RNA和其反向互补序列作
为反义RNA组成的双链RNA。SEQ ID NO.1如下所示：
[0034]TAATACGACTCACTATAGGGCTTGAATACACTGCCGAACTCTTTGGCCATTTTCTGTGTGGCCACTTACGGTGAAGGTGACCCTACGGATAATGCTTTAGATCTCAATGAATGGCTTCAAAATACAACTGTAGACCTCAATGGATTAAATTATGCCGTTTTTGGATTGGGTAACAAAACTTATGAACACTTCAATGCTTTTGGCAAATATATTGATAAAAGACTTGCAGAGTTAGGTGCAAATAGAGTTCATGAATTGGGCTTGGGTGATGATGATGCAAACATCGAAGAAGATTTTATCACATGGAAAGAACAGCTTTGGTCTTCTGTTTGTTCCCTTTTCAATGTCCAATTATCTGGAGAAGACATTAATCTGCGACAATATGAATTAGAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为正义RNA和其反向互补序列作为反义RNA组成的双链RNA。2.一种靶向朱砂叶螨CPR基因的dsRNA的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：得到朱砂叶螨总RNA；将所述朱砂叶螨总RNA中的基因组DNA进行去除，后进行反转录，得到cDNA；采用全长克隆引物对所述cDNA进行PCR基因克隆，得到RNAi
–
CPR引物对；提取CPR质粒；以所述CPR质粒和所述RNAi
–
CPR引物对进行RNAi片段的合成，得到扩增产物；回收所述扩增产物，并进行dsRNA的合成与纯化，得到dsRNA。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述得到朱砂叶螨总RNA的方式包括采用RNA提取试剂盒或Trizol法提取朱砂叶螨总RNA。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将所述朱砂叶螨总RNA中的基因组DNA进行去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏朋，王超，陈明，何林，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：