康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用以及基因编辑方法技术方案

本发明专利技术提供一种康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用以及基因编辑方法。本发明专利技术第一方面提供一种康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用，所述康乃馨DcU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用以及基因编辑方法


[0001]本专利技术涉及一种康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用以及基因编辑方法，涉及基因工程


技术介绍

[0002]康乃馨(Dianthus Caryophyllus L.)具有较高的观赏价值，是应用最普遍的四大切花之一，是世界上产量最大、产值最高的观赏花卉，普遍运用在园林绿化中。在康乃馨的育种过程中，传统育种技术仍然占据重要地位，但传统育种手段存在周期长、效率低的缺点；人工诱变虽然提高了变异频率，但定向育种精确度低；杂交育种虽然能弥补两者的不足，却也面临着远缘杂交不亲和，难以打破物种生殖隔离的问题。CRISPR
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Cas9基因编辑系统的建立有助于创造具有特定性状但不含有外源基因的花卉种质资源，消除了转基因植物的安全性忧虑，以基因编辑为代表的生物科技的高速发展，为定向培育出具有新奇花色、花香、延长花期的康乃馨新品种提供了全新的研究手段，提高了康乃馨定向育种的效率和精准度。
[0003]CRISPR
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Cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgRNA(guide RNA)来识别目的基因，并引导Cas9蛋白酶进行目的基因的切割，形成双链断裂，损伤后修复实现基因的敲除或插入。然而，在康乃馨的基因编辑过程中发现，启动sgRNA转录的启动子不同，sgRNA的转录水平不同，寻求具有更高转录活性的启动子受到了本领域技术人员的持续关注。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种可用于康乃馨CRISPR/Cas9基因编辑系统的DcU6启动子，该启动子能够高效驱动sgRNA表达，提高CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率，对实现康乃馨的育种具有重要意义。
[0005]本专利技术第一方面提供一种康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用，所述康乃馨DcU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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2所示。
[0006]进一步地，所述康乃馨DcU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本专利技术第二方面提供一种基因编辑载体，所述基因编辑载体包括上述任一所述的康乃馨DcU6启动子。
[0008]如上述基因编辑载体，所述基因编辑载体还包括用于靶向目的基因的sgRNA以及用于敲除所述目的基因的能够编辑cas蛋白的核苷酸序列。
[0009]如上述基因编辑载体，用于敲除所述目的基因的能够编辑cas蛋白的核苷酸序列为拟南芥基因组中的编码cas蛋白的核苷酸序列。
[0010]本专利技术第三方面提供一种基因编辑载体的构建方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1、将DcU6启动子序列、tracrRNA序列构建到pUC19载体上，并在所述DcU6启动子序列和tracrRNA序列之间引入BsbI酶切位点，构建得到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA
载体；
[0012]步骤2、将pro35S、编码拟南芥AtCas9的基因和Tnos终止子分别重组到pCAMBIA1300载体的XbaI酶切位点上，构建得到pCAMBIA1300
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35S
‑
AtCas9敲除载体；
[0013]步骤3、根据目标基因设计靶向目标基因的sgRNA序列，合成带有BsbI酶切位点序列的引物，退火形成sgRNA双链，通过Golden braid系统连接到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA载体的BsbI位点，设计引物扩增得到pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段；
[0014]步骤4、利用重组酶分别将所述pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段连接到pCAMBIA1300
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35S
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AtCas9敲除载体上，构建得到所述基因编辑载体。
[0015]本专利技术第四方面提供一种适用于康乃馨的CRISPR/Cas9基因编辑方法，包括如下步骤：
[0016]构建基因编辑载体；
[0017]获得康乃馨原生质体细胞；
[0018]将所述基因编辑载体瞬时转化所述康乃馨原生质体细胞，使所述基因编辑载体在康乃馨原生质体细胞表达，实现对目的基因的编辑。
[0019]如上述方法，所述构建基因编辑载体，具体包括如下步骤：
[0020]步骤1、将DcU6启动子序列、tracrRNA序列构建到pUC19载体上，并在所述DcU6启动子序列和tracrRNA序列之间引入BsbI酶切位点，构建得到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA载体；
[0021]步骤2、将pro35S、编码拟南芥AtCas9的基因和Tnos终止子分别重组到pCAMBIA1300载体的XbaI酶切位点上，构建得到pCAMBIA1300
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35S
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AtCas9敲除载体；
[0022]步骤3、根据目标基因设计靶向目标基因的sgRNA序列，合成带有BsbI酶切位点序列的引物，退火形成sgRNA双链，通过Golden braid系统连接到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA载体的BsbI位点，设计引物扩增得到pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段；
[0023]步骤4、利用重组酶分别将所述pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段连接到pCAMBIA1300
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35S
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AtCas9敲除载体上，构建得到所述基因编辑载体。
[0024]如上述方法，获得康乃馨原生质体细胞包括如下步骤：
[0025]取生长状态良好的康乃馨叶片，将叶片中间部分切成0.5
‑
1mm的叶条，将叶条放入酶解液中；将叶片和酶解液进行抽真空，并在黑暗条件下静置消化，待叶条基本消失后，得到包括原生质体细胞的酶解消化液。
[0026]如上述方法，将所述基因编辑载体瞬时转化所述康乃馨原生质体细胞，使所述基因编辑载体在康乃馨原生质体细胞表达，实现对目的基因的编辑，具体包括：
[0027]以等体积的W5溶液稀释所述酶解消化液，离心过滤后吸弃上清，收集原生质体，并使用W5溶液重悬，控制原生质体细胞的浓度为2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用，其特征在于，所述康乃馨DcU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述康乃馨DcU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体包括权利要求1
‑
2任一项所述的康乃馨DcU6启动子。4.根据权利要求3所述的基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体还包括用于靶向目的基因的sgRNA以及用于敲除所述目的基因的能够编辑cas蛋白的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的基因编辑载体，其特征在于，用于敲除所述目的基因的能够编辑cas蛋白的核苷酸序列为拟南芥基因组中的编码cas蛋白的核苷酸序列。6.权利要求3
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5任一项所述基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将DcU6启动子序列、tracrRNA序列构建到pUC19载体上，并在所述DcU6启动子序列和tracrRNA序列之间引入BsbI酶切位点，构建得到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA载体；步骤2、将pro35S、编码拟南芥AtCas9的基因和Tnos终止子分别重组到pCAMBIA1300载体的XbaI酶切位点上，构建得到pCAMBIA1300
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35S
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AtCas9敲除载体；步骤3、根据目标基因设计靶向目标基因的sgRNA序列，合成带有BsbI酶切位点序列的引物，退火形成sgRNA双链，通过Golden braid系统连接到pUC19
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proDcU6
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BsbI
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tracrRNA载体的BsbI位点，设计引物扩增得到pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段；步骤4、利用重组酶分别将所述pUC19
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proDcU6
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sgRNA
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tracrRNA片段连接到pCAMBIA1300
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35S
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AtCas9敲除载体上，构建得到所述基因编辑载体。7.一种适用于康乃馨的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：构建基因编辑载体；获得康乃馨原生质体细胞；将所述基因编辑载体瞬时转化所述康乃馨原生质体细胞，使所述基因编辑载体在康乃馨原生质体细胞表达，实现对目的基因的编辑。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：付雪晴，唐克轩，户欣怡，宋羽烨，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：