KLHL34敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及KLHL34敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。本发明专利技术首先发现，抑制宿主细胞中KLHL34基因表达能促进小RNA病毒科病毒FMDV的复制；其次，本发明专利技术提供了一种特异性靶向KLHL34的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向KLHL34基因，结合CRISPR

【技术实现步骤摘要】
KLHL34敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种KLHL34敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用。

技术介绍

[0002]小核糖核酸(RNA)病毒科(Picomaviridae)是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属等。口蹄疫(foot
‑
and
‑
mouth dis ease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot
‑
and
‑
mouth disease virus，FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，严重危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。FMDV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 7个血清型，且各型之间没有交叉免疫保护，即使同一血清型不同毒株抗原之间交叉免疫保护也存在差异。因其基因组为单股正链RNA，具有很高的变异性，易产生新毒株，导致疫苗不能完全覆盖田间流行毒株，这就给口蹄疫的免疫防控带来巨大挑战。开发高效疫苗是当前防控该病最有效的举措，而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备高效疫苗的前提，急需开展相关工作。
[0003]CRISPR
‑
Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。基于原核生物的适应性免疫防御系统研发出了CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，该技术就是通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂。通常情况下，细胞会采用非同源末端连接(Non
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homologous end joining,NHEJ)或同源重组修复(Homology
‑
directed repair,HDR)途径来对造成的断裂进行修复，实现基因的敲除与修饰。前者在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现特定基因的敲除。
[0004]KLHL34是Kelch样(KLHL)基因家族的一员，它编码一组具有BTB/POZ结构域、BA CK结构域和5
‑
6个Kelch基序的蛋白质。Perez
‑
Torrado等人论述了BTB/POZ结构域促进与其他蛋白质的结合，其功能涉及多种细胞内分子机制，包括细胞骨架组织的控制、离子通道的选择等，某些KLHL基因的突变会导致孟德尔疾病或人类癌症。
[0005]本专利技术意外发现，抑制宿主细胞中KLHL34基因的表达能促进小RNA病毒科病毒的复制，尤其是FMDV的复制；其次，本专利技术提供了一种特异性靶向KLHL34基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向KLHL34基因，结合CRISPR
‑
Cas9技术实现了KLHL34基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小RNA病毒的复制，尤其是FMDV的复制，提高小RNA病毒疫苗的生产量和抗原产量，可作为小RNA病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景；而且所述的KLHL34蛋白能够显著抑制口蹄疫病毒的复制，可用于预防或治疗口蹄疫病毒感染。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术首先发现，抑制宿主细胞中KLHL34基因的表达能促FMDV的
复制；其次，本专利技术提供了一种特异性靶向KLHL34基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向KLHL34基因，结合CRISPR
‑
Cas9技术实现了KLHL34基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进FMDV的复制，提高FMDV疫苗的生产量和抗原产量，可作为FMDV疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种KLHL34蛋白或表达KLHL34蛋白的重组载体/质粒在制备预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用。
[0008]优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种KLHL34基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。
[0010]优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。
[0011]第三方面，本专利技术提供了一种抑制或者沉默KLHL34基因表达的试剂在制备小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。
[0012]优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。
[0013]优选地，所述试剂包括靶向敲除KLHL34基因的sgRNA，或靶向敲除KLHL34基因的sgRNA与Cas9蛋白的mRNA序列。
[0014]优选地，所述sgRNA包括KLHL34
‑
sgRNA
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1和/或KLHL34
‑
sgRNA
‑
2；
[0015]所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
1的靶向序列为：TTGACGTGTACAACCACCGC；
[0016]所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
2的靶向序列为：GGCGTCGTGTACATCTCCGG。
[0017]优选地，所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
1由KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
F和KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
R退火形成的双链；所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
2由KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
F和KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
R退火形成的双链；
[0018]KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
F：5
’‑
CACCGTTGACGTGTACAACCACCGC
‑3’
；
[0019]KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
R：5
’‑
AAACGCGGTGGTTGTACACGTCAAC
‑3’
；
[0020]KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
F：5
’‑
CACCGGGCGTCGTGTACATCTCCGG
‑3’
；
[0021]KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
R：5
’‑
AAACCCGGAGATGTACACGACGCCC
‑3’
。
[0022]第四方面，本专利技术提供了一种特异性靶向KLHL34基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.KLHL34蛋白或表达KLHL34蛋白的重组载体/质粒在制备预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用。2.KLHL34基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。3.抑制或者沉默KLHL34基因表达的试剂在制备小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。4.如权利要求1
‑
3任一所述的应用，其特征在于，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。5.一种特异性靶向KLHL34基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括KLHL34
‑
sgRNA
‑
1和/或KLHL34
‑
sgRNA
‑
2；所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
1的靶向序列为：TTGACGTGTACAACCACCGC；所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
2的靶向序列为：GGCGTCGTGTACATCTCCGG。6.如权利要求5所述的sgRNA，其特征在于，所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
1是由KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
F和KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
R退火形成的双链片段；所述KLHL34
‑
sgRNA
‑
2是由KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
F和KLHL34
‑
sgRNA
‑2‑
R退火形成的双链片段；KLHL34
‑
sgRNA
‑1‑
F：5
’‑
CACCGTTGACGTGTACAACCACC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，冉乾东，杨帆，张伟，曹伟军，朱紫祥，范仲鑫，田宏，张克山，何继军，郭建宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：