一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法，通过将柑橘属植物中长链脂肪醇氧化酶CsFAO3基因的部分编码序列即如SEQ ID NO:3所示的序列作为干扰序列，导入干扰载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法整合到柑橘基因组中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。本发明专利技术的方法可对引起柑橘溃疡病的致病细菌的大部分进行了直接抑制，且所干扰的基因在大大提高柑橘对溃疡病的抗性的同时，最大程度上减少了对柑橘已知品质和性能的不良影响，开辟了柑橘抗溃疡病育种的另外一条途径，促进了柑橘抗溃疡病育种的发展。橘抗溃疡病育种的发展。橘抗溃疡病育种的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法。
技术背景
[0002]柑橘溃疡病是一种破坏性极强的细菌性病害，该病由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)引起，每年给世界的柑橘产业带来了巨大的经济损失。目前，防治溃疡病主要采取化学防治的方法，如对柑橘树喷洒铜制剂、己酸和苯三醇衍生的化合物等。然而，化学防治的方法对环境污染较严重，且需投入大量的人力、物力，因此，培育抗溃疡病的柑橘新品种是彻底解决柑橘溃疡病危害的有效途径。利用基因工程的手段，在柑橘中超量表达抗菌肽基因(Peng et al.2015)、CsBZIP基因(Li et al.2019)和对柑橘体内的感病基因CsLOB1(Peng et al.2017)进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑，均获得了溃疡病抗性增强的转基因柑橘植株。
[0003]中国专利申请CN114561397A公开了CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用，通过研究发现过量表达柑橘CsCaBP1基因能有效增强转基因植株对柑橘溃疡病的抗性。
[0004]中国专利申请CN110819607A公开了CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，将柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶编码基因CsLYK基因通过超表达载体整合到柑橘中,有效提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性。
[0005]中国专利申请CN101260399A公开了抗柑橘溃疡病pthA
‑
nls基因及其构建方法与应用，利用柑橘溃疡病的致病基因pthA介导广谱抗性原理，构建了抗柑橘溃疡病的新基因pthA
‑
nls，可进一步对柑橘的感病品种进行遗传转化，获得抗柑橘溃疡病的新种质。
[0006]以上专利申请都是通过对柑橘溃疡病相关基因的过量表达来实现对柑橘溃疡病的抗性，这些基因的过量表达会导致相关编码蛋白的大量产生，除对柑桔溃疡病的抗性产生影响外，可能还对柑橘本身的品质和性能等带来无法预期的不良影响。
[0007]中国专利申请CN114395570A公开了利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，得到的转基因植株CsNCED3的表达量显著下调至现有柑橘的29％，溃疡病发病程度可降低至现有柑橘的47％。
[0008]中国专利申请CN110283843A公开了一种基于CRISPR/Cas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，使CsWRKY22蛋白功能丧失或减少，实现了CsWRKY22基因在柑橘基因组中的成功编辑，获得CsWRKY22突变体转基因植株，增强植株对柑橘溃疡病的抗性，获得溃疡病抗性高的柑桔。
[0009]这两篇现有技术专利公开了利用抑制基因表达包括基因干扰或基因编辑来提高柑橘对溃疡病的抗性，但这些基因的下调表达并未证明对溃疡病细菌本身的增殖具有明显的抑制作用，不能从本质上保证溃疡病细菌不会再次增殖。同时，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在实现基因沉默的同时，在柑橘基因组中引入了一个Cas9基因，这个基因的存在会对转基因植株中与靶位点相似度较高的位点进行编辑，存在潜在的脱靶风险，对柑
橘本身的品质和性能可能带来无法预期的不良影响。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法。该方法是将CsFAO3基因的部分编码序列作为干扰序列，导入干扰载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法整合到柑橘基因组中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。
[0011]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0012]一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法为通过干扰RNA(RNAi)降低柑橘属植物中长链脂肪醇氧化酶CsFAO3基因的转录水平。
[0013]具体地，所述RNAi使用核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的干扰序列。
[0014]本专利技术所述方法包括以下步骤：(1)从柑橘CsFAO3基因中克隆所述干扰序列；(2)构建包含所述干扰序列的CsFAO3干扰表达载体；(3)用所述CsFAO3干扰表达载体转化柑橘得到转基因柑橘植株。
[0015]其中，步骤(1)中，所述干扰序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用PCR扩增得到所述干扰序列。
[0016]进一步地，步骤(1)中，PCR扩增所采用的引物为rCsFAO3
‑
F和rCsFAO3
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0017]进一步地，步骤(2)中，所述CsFAO3干扰表达载体的构建方法为：利用AscI和SwaI分别双酶切pUC
‑
RNAi载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的pUC
‑
RNAi载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接，构建出正向干扰序列载体；将正向干扰序列载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体再分别利用XbaI和BamHI进行双酶切，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的正向干扰序列载体大片段和干扰序列片段连接，构建同时包含正向和反向干扰序列片段的pUC
‑
RNAi
‑
CsFAO3干扰载体；最后，利用KpnI和SalI分别双酶切所述pUC
‑
RNAi
‑
CsFAO3干扰载体和pLGNe载体，利用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的所述正向和反向干扰序列片段和线性化的pLGNe载体连接，获得所述CsFAO3干扰表达载体。
[0018]进一步地，步骤(3)中，用所述CsFAO3干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过电击法将所述CsFAO3干扰表达载体导入农杆菌菌株EHA105，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体再经离体培养、染色鉴定、嫁接得到转基因柑橘植株。
[0019]进一步地，步骤(3)得到转基因柑橘植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsFAO3基因干扰与柑橘溃疡病抗性的相关性。
[0020]优选地，对转基因柑橘植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因柑橘植株，采用的引物为GUS
‑
F和GUS
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0021]更优选地，PCR验证后，用qRT
‑
PCR验证转基因柑橘植株中CsFAO3基因的转录水平，检测所采用的引物为qCsFAO3
‑
f和qCsFAO3
‑
r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；内参基因为柑橘Actin基因，采用引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法为通过干扰RNA（RNAi）降低柑橘属植物中长链脂肪醇氧化酶CsFAO3基因的转录水平。2.根据权利要求1所述的提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述RNAi使用核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的干扰序列。3.根据权利要求1或2所述的提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)从柑橘CsFAO3基因中克隆所述干扰序列； (2)构建包含所述干扰序列的CsFAO3干扰表达载体； (3)用所述CsFAO3干扰表达载体转化柑橘得到转基因柑橘植株。4.根据权利要求3所述的提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述干扰序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用PCR扩增得到所述干扰序列。5.根据权利要求4所述的提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增所采用的引物为rCsFAO3
‑
F和rCsFAO3
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。6.根据权利要求3
‑
5任一项所述的提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CsFAO3干扰表达载体的构建方法为：利用AscI和SwaI分别双酶切pUC
‑
RNAi载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的pUC
‑
RNAi载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接，构建出正向干扰序列载体；将正向干扰序列载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体再分别利用XbaI和BamHI进行双酶切，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的正向干扰序列载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接，构建同时包含正向和反向干扰序列片段的pUC
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭爱红，张婧芸，何永睿，陈善春，李强，姚利晓，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：