IBDVsiRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了通过筛选得到鸡传染性法氏囊病毒的siRNA基因库，并将该数据库与鸡传染性法氏囊病毒基因组比对得到一段siRNA富集区的基因片段的方法。我们发现IBDV的基因组上siRNA富集区可以高效产生siRNA并能够作为鸡传染性法氏囊病预防与治疗的应用，所述应用包括：使用pcDNA3.1和PSilence4.1商品质粒构建包含IBDVsiRNA富集区片段的重组质粒。经实验证明，使用重组质粒处理DF1细胞后，细胞中IBDV复制量显著降低，IBDV病毒的增殖被抑制。在使用雏鸡进行的动物保护实验中也能得到了相同结论。因此，该重组质粒可作为预防/治疗鸡传染性法氏囊病的候选疫苗。性法氏囊病的候选疫苗。性法氏囊病的候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】
IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物技术基因工程领域，具体涉及IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]1、IBDV流行现状及其防治难度
[0003]传染性法氏囊病毒(Infections bursal disease virus，IBDV)是一种能高度适应环境的非囊膜RNA病毒，能通过入侵鸟类特有的免疫器官法氏囊从而攻击免疫细胞、损伤免疫系统。其引起的这种高度接触性传染病称为传染性法氏囊病(Infections bursal disease，IBD)国内外出现具有更高的发病率和致死率变异株IBDV(vvIBDV)，给世界各国养鸡业带来巨大打击，至今，IBDV仍在不断变异传播，威胁养鸡业的发展。针对具有高传染性特点的IBDV，我国目前采取的预防措施主要包括：对养殖环境进行消毒、优化饲养条件提高抗病能力、免疫疫苗接种等方式。这些措施也面临着许多困难，首先，IBDV传染性强，可以通过接触、水、饲料、灰尘、器具、人员活动等各种方式进行传播并且IBDV在环境具有高适应性，这对环境消毒的方式和效果带来巨大挑战。其次，优化饲养条件，包括：使用优质饲料、饮用水，使用更精确的温度、湿度控制器，采取更科学的饲养方式等等，确实能增强鸡群免疫能力，但同时也大大提高了养殖的成本。最后，接种疫苗是目前对抗传染性病毒的主要预防措施，但IBDV在出现至今已经通过不断变异产生不同亚型的毒株，其展现出的高突变性对研制疫苗提出更高的要求。而研制疫苗既要考虑提高免疫原性产生强的保护能力又要求保证疫苗的安全性，同时要降低疫苗的生产成本，这使疫苗的研制困难重重。
[0004]2、RNAi有望成为有效治疗IBD的新方法
[0005]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体进化过程中相对保守的一种基因调控方式，该系统可以通过将双链RNA(double
‑
stranded RNA，dsRNA)切割成21
‑
23nt的小片段，并利用小片段沉默特定的mRNA的表达。RNAi系统自被发现以来，提供了一种通过靶向特定基因来调节靶基因表达的新方法并表现出了高靶向性和高效性。目前，RNAi系统主要被应用于治疗领域，包括对遗传性疾病、病毒性疾病、肿瘤疾病等治疗难度高的疾病的治疗。自2018年以来多种RNAi的药物通过临床试验并获得FDA批准，包括：patisiran、Givosiran、Lumasiran、inclisiran等，除此之外还有很多RNAi疗法已经进入了临床试验阶段。最近，越来越多的研究关注RNAi在抗病毒中的应用，目前已经发现，RNAi是植物和无脊椎动物中主要的抗病毒机制并且在脊椎动物抗病毒中也发挥着重要作用，目前，RNAi系统应用于病毒治疗的策略是：向机体递送siRNA小片段或能产生siRNA小片段的基因片段作为疫苗，这种治疗方式相较于传统的弱毒疫苗、灭活疫苗、蛋白疫苗治疗方式有很多优势，首先，siRNA疫苗的安全性很高，siRNA特异性很高能精准靶向特定靶基因，而且，游离RNA分子相对不稳定，一旦发生脱靶也很容易被酶降解。其次，RNAi在病毒感染的早期就能通过siRNA靶向病毒mRNA，干扰病毒的转录过程，反应迅速。并且病毒mRNA降解产生的小片段能进一步增强
RNAi作用，产生一个级联放大的效应，大大提高了siRNA疫苗的抗病毒能力。最后，RNAi疗法只需要提供siRNA，细胞中RNAi系统的其他组分结合siRNA就能调控靶基因，而随着生命科学的快速发展，降低了合成基因片段的难度和成本，使RNAi疗法面对不断的病毒变异，能快速生产针对新病毒的siRNA疫苗，减弱了病毒变异对疫苗研制造成的影响。
[0006]3.本专利技术在RNAi用于抗病毒领域解决的问题
[0007]RNAi系统随着不断深入研究，RNAi的具体机制也愈发清晰明了，其靶向mRNA沉默其表达的特点使其应用于各种领域，包括抗病毒领域。但在抵抗病毒的应用中也面临着一些问题，其中，最重要的一个问题就是如何大量获得siRNA，并且RNA在环境中并不稳定，在体外大量合成RNA直接免疫动物抵抗病毒的难度很高。目前的解决方式为通过大量合成能转录为一个RNA发卡结构(发卡结构中包含siRNA序列)的DNA质粒，质粒转入后会转录翻译为RNA发卡结构，这个结构被RNAi系统识别切割产生一条siRNA，从而进一步沉默病毒基因的表达。

技术实现思路

[0008]专利技术目的：本专利技术通过分析筛选得到一段富含IBDV siRNA序列的基因片段，使用该基因片段构建重组质粒相对使用发夹结构构建的质粒能更好的激活RNAi系统，产生更强的抗病毒效果，从而从一个更新的角度解决如何大量获得siRNA的技术问题，发现了siRNA应用于抗病毒的新方法。
[0009]本专利技术所要解决的技术问题是筛选分析得到了一段禽传染性法氏囊病毒(IBDV)的siRNA富集区片段。
[0010]本专利技术还构建了含有该富集区片段的重组质粒，该重组质粒具有抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)感染功能。
[0011]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种禽传染性法氏囊病毒(IBDV)的siRNA富集区基因片段及其重组质粒的构建方法。
[0012]本专利技术还要解决的技术问题是提供重组质粒或细胞系，所述重组质粒为真核载体，所述细胞系为表达细胞系，其能在细胞模型中抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)感染。
[0013]其中，该细胞系包括但不仅限于鸡成纤维细胞(DF
‑
1)。
[0014]本专利技术还要解决的技术问题是提供重组质粒用于滴鼻的体外包裹方式和动物模型上的使用方法。
[0015]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种IBDV的siRNA富集区基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0016]本
技术实现思路
还包括一种IBDV的siRNA富集区基因片段的筛选方法，包括以下步骤：
[0017](1)在NCBI的GEO数据库中收集整理IBDV感染后产生的21
‑
23bp的siRNA序列；
[0018](2)将(1)中收集得到的siRNA序列数据，通过snapgene软件与IBDV基因组序列进行分析比对；
[0019](3)将(2)中分析比对数据使用基因组可视化软件IGV软件进行数据可视化，得到IBDV基因组序列上siRNA最多的区域，即为IBDV的siRNA富集区。
[0020]本
技术实现思路
还包括一种IBDV的siRNA富集区重组质粒，所述重组质粒包括所述的基因片段。
[0021]本专利技术的重组质粒，分别命名为pcDNA3.1
‑
siRNA和psliencer 4.1
‑
siRNA，其含有siRNA富集区片段，其图谱见说明书图3和图4。
[0022]本
技术实现思路
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IBDV的siRNA富集区基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种IBDV的siRNA富集区基因片段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在NCBI的GEO数据库中收集整理IBDV感染后产生的21
‑
23bp的siRNA序列；(2)将(1)中收集得到的siRNA序列数据，通过snapgene软件与IBDV基因组序列进行分析比对；(3)将(2)中分析比对的数据使用IGV软件进行数据可视化，得到IBDV基因组序列上siRNA最多的区域，即为IBDV的siRNA富集区片段。3.一种IBDV的siRNA富集区重组质粒或细胞系，其特征在于，所述重组质粒或细胞系包括权利要求1所述的基因片段。4.一种使用IBDV的siRNA富集区构建重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过对IBDV分析筛选得到能有效抑制IBDV复制的siRNA富集区基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)所筛选出的基因片段连接在能表达产生siRNA的质粒上，构建能表达小siRNA的重组质粒。5.根据权利要求4所述的构建重...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建，赵晋豪，吴耀棠，杨倩，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：