敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体和应用制造技术

本发明专利技术提供了敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体和应用。本发明专利技术发现敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体在促进造血干/祖细胞动员以及促进骨髓造血干/祖细胞增殖和迁移中具有显著的效果。著的效果。著的效果。

【技术实现步骤摘要】
敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种减少Metrn表达的shRNA，本专利技术还涉及一种敲除Metrn基因的慢病毒载体，以及Metrn敲除促进造血干/祖细胞增殖和动员的应用。

技术介绍

[0002]造血干/祖细胞(Hematopoietic stem progenitor cells,HSPC)是机体中非常重要的的成体干细胞，主要存在于骨髓微环境中，可以特异性的分化为淋巴系、髓系和红系祖细胞，是血细胞的起源。HSPC响应外源性刺激从骨髓外排到循环系统的过程即为HSPC的动员。从骨髓动员到外周血的HSPC是临床上造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT)使用的主要细胞，可以使患者重建正常的造血免疫系统，对于白血病、恶性血液病、肿瘤等疾病的治疗非常重要。而在正常生理条件下，外周血的HSPC数量较少，需要使用药物促进骨髓HSPC产生并动员到外周血中。目前临床上最常用的动员剂为G
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CSF，然而单独使用G
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CSF经常会出现动员失败的问题，因此亟需寻找其他有效的促进HSPC动员的方法。
[0003]Meteorin(Metrn)是具有血管生成特性的神经营养调节因子，属于分泌蛋白，分子量约为31kDa，由10个保守的Cys残基构成5个二硫键。Metrn于2004年最先被报道，并最初被发现主要在中枢神经系统中表达，发挥神经保护的作用。随着研究的深入，人们发现它还参与许多其他生理过程，如促进神经伸长迁移、心血管新生、血管成熟、抗痛觉过敏等。近年来，Metrn已经被认为是血液和内分泌疾病的生物标志物。
[0004]RNA干扰是通过siRNA或shRNA诱导mRNA降解以沉默基因表达的过程，被认为是现代生物技术的一个里程碑，然而siRNA以及shRNA的低效转染是限制其治疗的重要障碍。慢病毒载体是一种成熟的体内基因转移载体，能够有效在分裂细胞和分裂后细胞中稳定表达转基因，因此可以大大提高shRNA的转染效率。目前，慢病毒介导shRNA已经在癌症等疾病的基因机制研究和基因治疗中发挥出了重要作用。
[0005]目前尚无研究表明Metrn基因与造血干/祖细胞的增殖和动员相关，也无文献表明抑制Metrn表达可以促进造血干/祖细胞的增殖和动员。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种抑制Metrn表达的短发卡shRNA、敲除质粒、敲除Metrn基因shRNA慢病毒载体以及相关应用，以为造血干/祖细胞的增殖和动员提供一种新的有效方案。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]抑制Metrn表达的短发卡shRNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的碱基序列。
[0009]根据本专利技术的第二个方面，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种敲除质粒，其特征在于，该质粒含有上述的核苷酸序列。
[0011]根据本专利技术的第三个方面，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]一种敲除Metrn基因shRNA慢病毒载体，其特征在于，将上述的抑制Metrn表达的短发卡shRNA插入慢病毒载体质粒pHAGE
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GFP所得。
[0013]上述敲除Metrn基因表达的慢病毒载体构建方法，具体包括合成用于编码敲除Metrn的shRNA核苷酸片段；用限制性内切酶EcoRⅠ和SpeⅠ分别对上述核苷酸片段和pHAGE
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GFP载体进行双酶切；将酶切后的核苷酸片段和pHAGE
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GFP载体进行连接，得到重组的敲除Metrn慢病毒载体。
[0014]根据本专利技术的第四个方面，本专利技术采用以下有关应用的技术方案：
[0015]上述的抑制Metrn表达的短发卡shRNA在制备促进造血干/祖细胞动员药物以及制备促进骨髓造血干/祖细胞增殖和迁移药物中的应用。
[0016]上述的一种敲除质粒在制备促进造血干/祖细胞动员药物以及制备促进骨髓造血干/祖细胞增殖和迁移药物中的应用。
[0017]上述的敲除Metrn基因shRNA慢病毒载体在制备促进造血干/祖细胞动员药物以及制备促进骨髓造血干/祖细胞增殖和迁移药物中的应用。慢病毒注射方式可以是静脉注射，也可以皮内、经皮或局部经予；本专利技术敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体可一次性给予或24小时内多次给予或连续给予。
[0018]以上应用不仅限于Metrn基因的shRNA或敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体单独使用，也可与其它药物联合用于造血干/祖细胞增殖和动员、促进骨髓造血干/祖细胞增殖和迁移。
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术为制备造血干/祖细胞增殖和动员提供了一种新的方法，可促进造血干/祖细胞动员药物的开发；从而为造血干/祖细胞临床用于临床治疗提供基础，补充Metrn在造血干/祖细胞功能研究中的空白。本专利技术的shRNA不仅可用于制备造血干/祖细胞药物，也可以用于Metrn在造血干/祖细胞增殖和动员中的作用机制研究。
附图说明
[0021]图1为本专利技术敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体制备和DNA质粒图谱示意图。
[0022]图2为不同细胞Metrn表达量图，显示了Metrn在骨髓巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和造血干细胞的表达；其中，A：Metrn mRNA在骨髓巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和造血干细胞的表达量，***P<0.001vs骨髓巨噬细胞组。
[0023]图3为Metrn骨髓表达量图，显示了敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理降低Metrn在骨髓中的表达量；其中，A：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体1和2处理后Metrn在骨髓中的表达量，**P<0.01vs shCon组。
[0024]图4为骨髓造血干/祖细胞动员图，显示了敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理增加骨髓造血干/祖细胞的动员；其中，A：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理后骨髓中造血干/祖细胞的数目，*P<0.05vs shCon组；B：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理后骨髓中造血干细胞的数目，*P<0.05vs shCon组；C：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理后血液中造血干/祖细胞的数目，***P<0.001vs shCon组；D：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理后血液中造血干细胞的数目，***P<0.001vs shCon组。
[0025]图5为造血重建图，显示了敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理增加竞争性造血重建单位；其中，A：敲除Metrn基因的shRNA慢病毒载体处理后的竞争性造血重建单位。
[0026]图6为造血干/祖细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抑制Metrn表达的短发卡shRNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的碱基序列。2.一种敲除质粒，其特征在于，该质粒含有如权利要求1所述的核苷酸序列。3.一种敲除Metrn基因shRNA慢病毒载体，其特征在于，将如权利要求1所述的抑制Metrn表达的短发卡shRNA插入慢病毒载体质粒pHAGE
‑
GFP所得。4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆新江，马俊铠，戴优武，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：