一种抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因功能研究领域，具体涉及一种通过抑制鸡Wnt3a(Wnt family member 3A)基因表达的ASO及其应用。本发明专利技术公开了一种抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO，所述ASO的核苷酸序列为5

【技术实现步骤摘要】
一种抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO及其应用


[0001]本专利技术属于基因功能研究领域，具体涉及一种通过抑制鸡Wnt3a(Wnt family member 3A)基因表达的ASO及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着禽流感事件对家禽行业负面影响的加重和大众对食品安全的重视，家禽行业进入重要变革时期。活鸡市场的逐步关闭、屠宰后冷鲜上市已经成为不可逆转的趋势。鸡屠体外观逐渐成为消费者的关注重点，毛囊密度和直径的大小是屠宰后的鸡屠体外观的重要性状特征。消费者通常更青睐于密而小的皮肤毛囊屠体外观。因此，皮肤毛囊的大小将成为育种工作者重点关注和加强选择的性状。
[0003]Wnt3a(Wnt family member 3A)基因属于Wnt基因家族，在毛囊的生长发育中具有重要作用。Wnt3a对鸡毛囊的大小起到重要作用，Wnt3a能够增加真皮厚度，扩大了脊髓束大小，减少芽间距，同时影响鸟类羽毛类型和羽毛颜色，对黄羽肉鸡胚胎期羽囊形态发生起到重要调控作用。然而目前为止，在鸡上，还未有Wnt3a分子调控机制的阐述。
[0004]反义寡核酸(ASO，Antisense oligonucleotide)是指15～25个核苷酸的化学修饰短链核酸，依赖RNase H发挥功能，能够特异性敲降细胞质和细胞核内的RNA，是一种RNA干扰技术，通常用于沉默lncRNA。前期通过siRNA技术对体外培养的皮肤组织中的Wnt3a基因表达进行干扰，发现干扰效率极低，并不实现对Wnt3a基因进行功能研究，进而阻碍了揭示鸡羽毛毛囊生长发育相关性状的调控机制。
[0005]因此，急需一种能够干扰鸡胚皮肤组织Wnt3a基因表达的小RNA片段，能够有助于揭示鸡羽毛毛囊生长发育相关性状的调控机制，提升我国家禽产品的市场竞争力。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的干扰鸡胚皮肤组织Wnt3a基因表达的小RNA片段，提供一种靶向鸡Wnt3a基因的ASO片段。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO，所述ASO的核苷酸序列为5
’‑
AGUGCAGUUCAUUAGCUUCU
‑3’
(SEQ ID NO.3)。
[0008]第二方面，本专利技术还提供了含有所述抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
[0009]第三方面，本专利技术还提供了一种含有所述抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO的试剂盒。
[0010]进一步地，所述试剂盒还包括用于检测鸡Wnt3a基因表达的引物组。
[0011]第四方面，本专利技术还提供了所述的ASO，所述的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌，所述的试剂盒，在鉴定鸡Wnt3a基因功能中的应用。
[0012]本专利技术相对于现有技术而言，提供了一种能够靶向鸡Wnt3a基因的ASO序列，将其转入鸡体外培养的鸡胚皮肤组织后可以有效降低鸡Wnt3a基因的表达，抑制效率达到50％以上，可见其敲降效率很高。本专利技术的ASO序列通过特异性敲降鸡Wnt3a基因的表达来鉴定
基因功能，可应用于优质鸡的遗传育种、鸟类羽毛颜色以及为人类疾病研究提供参考数据，具有很大的经济价值和科研价值。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0014]图1是3条不同ASO干扰体外培养的鸡皮肤组织Wnt3a基因表达的效率，其中，*表示ASO干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；**表示ASO干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；
[0015]图2Western blot检测ASO干扰体外培养的鸡皮肤组织Wnt3a基因蛋白表达的效率，其中，*表示ASO干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；
[0016]图3是实时荧光定量PCR检测ASO干扰体外培养的鸡皮肤组织Wnt3a表达敲低后对羽毛毛囊生长发育标志基因Ctnnb1 mRNA表达的影响，其中，*表示ASO干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；
[0017]图4是Western blot检测ASO干扰体外培养的鸡皮肤组织Wnt3a基因表达敲低后对羽毛毛囊生长发育标志基因Ctnnb1蛋白表达的影响，其中，*表示ASO干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；
[0018]图5是采用HE染色切片技术检测ASO干扰体外培养的鸡皮肤组织Wnt3a基因表达敲低后对羽毛毛囊生长发育的影响。
具体实施方式
[0019]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中如无特别说明，均为常规方法，所用的试剂均为市售试剂。
[0020]实施例1靶向鸡Wnt3a基因ASO最佳序列筛选
[0021]1.ASO设计
[0022]根据NCBI在线数据库，获得鸡Wnt3a基因mRNA序列信息(登录号：NM_001171601.3)，设计3条靶向鸡Wnt3a基因的ASO序列，由广州锐博生物科技有限公司合成，对照NC由中国广州锐博生物科技有限公司提供。设计获得的3条ASO的序列如表1所示。
[0023]表1 3条ASO序列
[0024]ASO序列(5
’‑3’
)序列编号Wnt3aaso
‑
1CUCGAAAUUGGUGUUGGCACSEQIDNO.1Wnt3aaso
‑
2UGAUAGAGGUCCUUCCAGCUSEQIDNO.2Wnt3aaso
‑
3AGUGCAGUUCAUUAGCUUCUSEQIDNO.3
[0025]表2 3条ASO的靶向序列
[0026]ASO靶向序列(5
’‑3’
)序列编号Wnt3aaso
‑
1GTGCCAACACCAATTTCGAGSEQIDNO.4
Wnt3aaso
‑
2AGCTGGAAGGACCTCTATCASEQIDNO.5Wnt3aaso
‑
3AGAAGCTAATGAACTGCACTSEQIDNO.6
[0027]2.ASO转染体外培养鸡胚皮肤组织
[0028]从鸡胚组织中分离培养的皮肤组织保持了皮肤在体内许多重要生物学特征和功能，因此，体外培养皮肤组织被广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，在生物医药领域更具有不可替代性的作用。但相对于细胞，鸡胚皮肤组织的外源基因转染效率低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO，其特征在于，所述ASO的核苷酸序列为5
’‑
AGUGCAGUUCAUUAGCUUCU
‑3’
(SEQ ID NO.3)。2.含有权利要求1所述抑制鸡Wnt3a基因表达的ASO的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬改革，束婧婷，巨晓军，章明，单艳菊，屠云洁，刘一帆，邹剑敏，盛中伟，肖芹，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：