一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法技术

本发明专利技术涉及的一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNA方法，包括设计和制备siRNA(干扰载体)，siRNA是根据瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的保守cDNA序列进行设计，包含的干扰片段，干扰片段为：其正义链为5

【技术实现步骤摘要】
一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法


[0001]本涉及RNA干扰防治害虫领域，具体的是一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法。

技术介绍

[0002]瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae(Coquillett)属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)，是热带亚热带区域果蔬类作物的重要害虫。雌性瓜实蝇将产卵器刺入瓜果产卵，卵孵化成幼虫后在瓜果内取食，导致瓜果腐烂，对经济造成了巨大损失。瓜实蝇成虫不取食瓜果和叶片，喷施药剂的防治方法并不理想，繁殖速度快，产卵量大，分布范围广等特性使瓜实蝇的危害极其严重。
[0003]卵黄原蛋白受体是卵黄原蛋白(Vitellogenin，Vg)摄取进入发育的卵母细胞所必需的蛋白。卵黄原蛋白受体是具有介导内吞作用的受体，通常具有卵巢特异性，是卵黄原蛋白的专一性胞吞作用受体，卵黄原蛋白受体介导卵黄原蛋白进入昆虫卵母细胞后沉淀积累形成昆虫生殖必须的卵黄蛋白。卵黄原蛋白受体介导的胞吞作用是一个动态循环过程，它是卵黄发生的基础，对昆虫卵母细胞发育起着至关重要的作用。
[0004]RNA干扰是由和靶标基因序列同源的双链RNA介导的特异性基因表达沉默抑制现象，是生物的一种古老并且在进化上保持高度保守的调节基因表达机制。双链RNA(dsRNA)会被细胞内的核酸内切酶Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)，siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与一些酶(Argonaute)结合成沉默复合物(RISC)，RISC与靶mRNA结合，切割mRNA，导致特定基因沉默。本提出一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法，可有效抑制瓜实蝇的繁殖。
[0005]内容
[0006]为了克服现有技术中的至少部分缺陷，本专利技术提供了一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法，以制定科学的瓜实蝇防治措施。
[0007]本专利技术涉及一种RNA干扰载体，包括干扰片段，所述干扰片段的
[0008]正义链为5
’
CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT 3
’
，
[0009]反义链为5
’
UAACACAUCCUCGACAUCGTT 3
’
。
[0010]本专利技术还涉及RNA干扰载体在制备抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的药物中的应用。
[0011]本专利技术还涉及一种RNA干扰载体的制备方法，包括将包含siRNA干粉的离心管在3000
‑
4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时干粉散失，然后将2.5nmol的siRNA干粉溶解在125μL Tris
‑
EDTA溶液中，配制成20μM的siRNA溶液。
[0012]本专利技术还涉及一种RNA干扰载体的在抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的应用，包括以下步骤：取初羽化的瓜实蝇成虫在25℃和45℃的人工气候箱中分别处理1h，处理完成后继续在25
±
1℃条件下饲养，待饲养至5日龄，对存活雌成虫进行乙醚迷晕，将其放入容器中，使用微量上样针取4.5μL(1.25μg)的siRNA溶液注入注射针中，然后将注射针安装
到气压注射仪上并加以固定，选取雌成虫腹部背板第2至第3腹节的连接处为注射点，使用气压显微注射仪以1.25μg或4.5μL的注射量为每头瓜实蝇成虫注射siRNA。
[0013]进一步地，还包括：待瓜实蝇成虫注射siRNA注射完成并饲养一定时间后，使用RNAprep FastPure动物组织/细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA，在琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，1
×
TAE电泳缓冲液)和吸光度检测后，使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix逆转录试剂盒合成提取的总RNA，合成cDNA，逆转录得到的cDNA产物3倍稀释后作为qPCR模板，通过琼脂糖凝胶电泳得到条带，并对条带大小和qRT
‑
PCR的溶解曲线进行分析，判断siRNA的特异性，在实际实施过程中，通过琼脂糖凝胶电泳得到条带大小与预期的大小一致，没有杂带出现。qRT
‑
PCR的溶解曲线只有一个信号峰，说明引物的特异性较高，结果可靠。
[0014]进一步的，qRT
‑
PCR反应体系包含1μL cDNA模板，10μL 2
×
T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)、1μL上游引物、1μL下游引物和7μLddH2O，反应程序为：在95℃下预变性2min，在95℃下变性15s，在60℃下退火15s，在72℃下延伸20，共进行41个循环。
[0015]本专利技术的有益之处在于：通过使用RNAi技术，以卵黄原蛋白受体基因为靶标基因，使用气压显微注射仪对短时高温处理过的瓜实蝇注射卵黄原蛋白受体基因的siRNA，再结合qRT
‑
PCR技术和解剖卵巢，评价RNA干扰的沉默效率，研究高温背景下瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的功能，进而实现对瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的沉默和抑制，从而有效的降低瓜实蝇的繁殖能力。
[0016]为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1是干扰靶基因后对瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达量的影响。
[0019]图2是25℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响。
[0020]图3是45℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响。
[0021]图4是干扰靶基因对瓜实蝇产卵的影响。
[0022]图5是抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法的流程示意图。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]参照图5，在本专利技术一较佳实施例中的一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法，包括设计和制备siRNA(干扰载体)，siRNA是根据瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因
的保守cDNA序列进行设计，包含的干扰片段，干扰片段为：
[0025]其正义链为5
’
CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT 3
’
，
[0026]反义链为5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA干扰载体，用于抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达，其特征在于，包括干扰片段，所述干扰片段的正义链为5
’
CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT3
’
，反义链为5
’
UAACACAUCCUCGACAUCGTT 3
’
。2.权利要求1所述的RNA干扰载体在制备抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的药物中的应用。3.一种RNA干扰载体的制备方法，其特征在于，包括将包含siRNA干粉的离心管在3000
‑
4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时干粉散失，然后将2.5nmol的siRNA干粉溶解在125μL Tris
‑
EDTA溶液中，配制成20μM的siRNA溶液。4.一种RNA干扰载体在抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的应用，其特征在于，包括以下步骤：取初羽化的瓜实蝇成虫在25℃和45℃的人工气候箱中分别处理1h，处理完成后继续在25
±
1℃条件下饲养，待饲养至5日龄，对存活雌成虫进行乙醚迷晕，将其放入容器中，使用微量上样针取4.5μL(1.25μg)的siRNA溶液注入注射针中，然后将注射针安装到气压注射仪上并加以固定，选取雌成虫腹部背板第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：周世豪，连宇阳，王阿强，彭四华，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：