一种烟草环状RNANRC2、病毒诱导的基因沉默载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种烟草环状RNA NRC2、病毒诱导的基因沉默载体及其应用。本发明专利技术的烟草环状RNA NRC2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明专利技术构建环状RNA NRC2沉默植株，检测证明，转基因沉默植株中多种生物碱含量明显降低，说明环状RNA NRC2参与烟草生物碱合成的过程。同时，转基因沉默植株中茉莉酸(JA)和茉莉酸

【技术实现步骤摘要】
一种烟草环状RNA NRC2、病毒诱导的基因沉默载体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种烟草环状RNA NRC2、病毒诱导的基因沉默载体及其应用，属于烟草基因工程


技术介绍

[0002]烟草(Nicotiana tabacum L.)是重要的经济作物，也是自然界生物量最大的植物之一，具有极大的挖掘利用潜力。
[0003]生物碱是存在与生物体内的有机碱性物质，生物碱主要存在于植物体内，常称为植物碱，植物界只有少部分植物体内含有植物碱，一种植物可以含有一种或多种植物碱，多者可达20多种。烟草生物碱是烟属含量很高的一类植物碱，烟叶中主要生物碱有烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱等。烟草生物碱主要影响烟叶的质量，因此，研究烟草中生物碱的分布、合成机理和生理功能等对烟叶质量的提高和烟草其他利用提供重要帮助。
[0004]茉莉酸(jasmonic acid，JA)是植物重要的生长调节剂，在植物生长过程中起到调控作用，一方面其可以调节植物的生长发育，另一方面茉莉酸还参与植物的生物胁迫和非生物胁迫的防御反应，如植物抵御草食动物(如：昆虫等)的侵袭等。申请授权号为CN110305884B的中国专利技术专利文件公开了“一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用”，通过核酸干扰技术，构建NtAOS1的转基因沉默植株，经检测发现，转基因沉默株中茉莉酸含量显著高野生型对照。
[0005]环状RNA(circRNAs)是由反向剪接事件产生的共价闭合单链RNA分子，过去常被认为是剪接的副产物。随着高通量RNA测序和高效鉴定方法的发展，环状RNA已被广泛识别，首先在人类中发现，然后在不同的哺乳动物和植物中也相继发现。环状RNA是一种新的调控分子家族，具有多种生物学作用，包括控制转录、调节选择性剪接以及与蛋白质和miRNAs结合。但是目前大多数circRNA的研究都是在动物上进行的，包括circRNA的生物起源、功能和分子特征等。
[0006]相比之下，植物中环状RNA的研究，特别是其机制的研究还处于起步阶段。研究发现和动物circRNA相比，植物circRNA有着一些独特特征，包括在应激反应中的功能、表达模式的变化和新的生物发生过程。环状RNA是植物中重要的调控因子之一，参与植物的许多生物过程，包括胁迫反应、表达模式的变化等。然而，作为一种特殊的调控分子，环状RNA在烟草生物碱及茉莉酸合成方面研究较少。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，本专利技术的第一个目的是提供一种烟草环状RNA NRC2，通过抑制环状RNA NRC2的表达，烟草中多种生物碱含量明显降低，证明其与烟草生物碱合成密切相关。而且环状RNA NRC2沉默株中，茉莉酸和茉莉酸
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异亮氨酸含量显著上升，为烟草抗逆育种与后续烟草中茉莉酸合成代谢途径的研究提供了材料基础。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供烟草环状RNA NRC2在调控烟草生物碱合成中的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供病毒诱导的基因沉默载体。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供烟草环状RNA NRC2或病毒诱导的基因沉默载体在获得高茉莉酸烟草品种中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0012]一种烟草环状RNA NRC2，其特征在于：所述环状RNA NRC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
[0013]本专利技术通过circRNA
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Seq测序首次在烟草中鉴定出环状RNA NRC2，通过PCR扩增和Sanger测序验证，其在烟草中能成环状结构，且通过qRT
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PCR检测发现其在烟草的各个组织中都有表达，但在烟草叶、花和根部中的表达量最高。
[0014]具体地，所述环状RNA NRC2的结构由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列转录后形成的首尾相连的封闭环状RNA结构。
[0015]一种烟草环状RNA NRC2在调控烟草生物碱合成中的应用。
[0016]本专利技术通过抑制烟草中环状RNA NRC2的表达，发现烟草中多种生物碱的含量显著下降，证明其与生物碱合成密切相关。
[0017]优选地，抑制环状RNA NRC2的表达，烟草中生物碱含量降低。
[0018]进一步优选地，所述生物碱为香豆酰酪胺(P
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coumaroylpurescine)、2,3'
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联吡啶(2,3
’‑
Bipyridine)和阿魏酰腐胺(N
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Feruloylputrescine)。
[0019]病毒诱导的基因沉默载体，所述病毒诱导的基因沉默载体包括环状RNA NRC2的成环核苷酸片段；所述成环核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
[0020]本专利技术成功构建出沉默环状RNA NRC2的病毒诱导的基因沉默载体，转染烟草植株后，经检测烟草中环状RNA NRC2的表达量显著下降。
[0021]优选地，所述病毒诱导的基因沉默载体的制备方法包括以下步骤：以所述成环核苷酸片段为引导序列，连接到表达载体上，筛选鉴定后获得。
[0022]一种烟草环状RNA NRC2或病毒诱导的基因沉默载体在获得高茉莉酸烟草品种中的应用。
[0023]本专利技术将构建的病毒诱导的基因沉默载体转染烟草后，获得环状RNA NRC2表达抑制的烟草植株，经检测转基因沉默株中茉莉酸和茉莉酸
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异亮氨酸的含量显著增加，茉莉酸和茉莉酸
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异亮氨酸含量的提高可以有助于植物的抗虫、抗逆，这为培育新的高茉莉酸的植物新品种奠定基础，为新的抗虫、抗逆植物新品种的培育提供新的基因资源。
[0024]优选地，通过抑制环状RNA NRC2的表达，提高烟草中的茉莉酸和茉莉酸
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异亮氨酸的含量，获得高茉莉酸的烟草品种。
附图说明
[0025]图1为本专利技术实验例2中环状RNA NRC2的鉴定和验证(a.PCR扩增结果，设计Convergent引物和Divergent引物分别从栽培烟草红花大金元叶片和根的cDNA和基因组DNA扩增circRNA NRC2线性序列和接头处环状序列的结果；b.Sanger测序结果，红色箭头表示首尾节点处序列；c.circRNA NRC2在组织叶、根、茎、花、和芽中qRT
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PCR结果，1和2分别表示2个不同的采样时期，1代表打顶前，2代表打顶后，蓝色表示不加RNase R外切酶，红色表示加入RNAse R外切酶)；
[0026]图2为本专利技术实验例3中野生型和NRC2沉默植株根中NRC2表达值以及多种生物碱和茉莉酸含量(红色表示野生型，蓝色表示NRC2沉默植株)；
[0027]图3为本专利技术实验例3中野生型和NRC2沉默植株叶中NRC2表达值以及多种生物碱和茉莉酸含量(红色表示野生型，蓝色表示NRC2沉默植株)。
具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草环状RNA NRC2，其特征在于：所述环状RNA NRC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。2.一种如权利要求1所述的烟草环状RNA NRC2在调控烟草生物碱合成中的应用。3.根据权利要求2所述的烟草环状RNA NRC2在调控烟草生物碱合成中的应用，其特征在于：抑制环状RNA NRC2的表达，烟草中生物碱含量降低。4.根据权利要求2所述的烟草环状RNA NRC2在调控烟草生物碱合成中的应用，其特征在于：所述生物碱为对香豆酰酪胺、2,3'
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联吡啶和阿魏酰腐胺。5.病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：所述病毒诱导的基因沉默载体包括权利要求1所述的环状RNA NRC2的成环核苷酸片...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶界锰，孟利军，金静静，卢鹏，许亚龙，徐馨，李泽锋，王晨，曹培健，程令通，苏欢，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：