一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA探针组，由针对薄荷与留兰香的核基因组ITS2序列差异位点设计的两条右探针和一条共同左探针组成，各探针的序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA探针组及其应用


[0001]本专利技术属于中药材鉴定领域，具体涉及一种鉴定中药材薄荷及其常见混伪品留兰香的特异性MLPA(多重连接依赖性探针扩增，Multiplex ligation
‑
dependent Probe Amplification)探针组，本专利技术还涉及一种利用MLPA技术结合熔解曲线快速鉴定中药材薄荷及其混伪品留兰香的方法。

技术介绍

[0002]薄荷为唇形科薄荷属植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，薄荷既是一种药用植物，其加工产物在食品、香料、化妆品等领域也有广泛应用。据报道，世界上约有薄荷属植物30种，其中变种有140多种。薄荷属植物对环境的适应能力强，分布范围广泛，有性和无性繁殖并存，自然杂交现象普遍，易在外观形态上产生变异，加上各地别名众多，使用传统的方法对其进行鉴别非常困难，由此造成薄荷品种混乱，出现代用或混用现象，对临床用药安全带来隐患。其中留兰香是薄荷最常见的伪品，来源于同属植物留兰香Mentha spicata Linnalus.及皱叶留兰香M.crispata Schrader ex Willd的地上部分。二者的外观形态相似，且经过干燥处理后仅从外观性状更加难以鉴别。薄荷的主要成分为薄荷脑，不含香芹酮，具疏散风热、清利头目的功效；而留兰香的主要成分为香芹酮，少含薄荷脑，具和中理气、祛风散寒、消炎止痛的功效。二者化学成分和功能主治存在较大差异，因此，以留兰香替代薄荷使用将直接影响临床药效，建立一种简便可靠的薄荷、留兰香鉴别方法对于保障药材安全有效使用十分必要。
[0003]相比于性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别来说，分子生物学鉴定技术准确性高、重现性好、不易受环境因素和加工炮制方法的影响。目前，ITS2序列在药用植物的鉴定中已经得到了大量应用，并已建立针对ITS2序列的薄荷DNA条形码，但条形码技术需要对扩增产物进行双向测序，操作较为复杂，且不能有效鉴别掺伪药材。多重连接依赖探针扩增技术是近年发展起来的一种DNA定性和半定量分析的核酸检测技术，可同时检测40～50个核苷酸序列，该技术操作简单，样品不易受到污染，特异性高，结果准确，已被应用到川贝母、人参、金银花、木通等中药材的掺杂快速鉴定中。
[0004]基于此，本研究在传统MLPA技术的基础上引入了熔解曲线分析，利用饱和荧光染料易与DNA双链结合的特点，通过实时监控DNA双链熔解过程中荧光信号的积累，就能直观地看到DNA双链熔解随温度变化曲线的差异，通过Tm值的差异将不同的物种分开。通过序列筛查和比对发现，薄荷与留兰香的核基因序列存在多个SNP位点，因此，针对薄荷与留兰香核基因片段序列的G/A、T/C、C/G等多个变异位点设计特异性探针，由熔解曲线分析获取扩增产物的熔解温度，根据熔解温度差异鉴别薄荷与留兰香，通过对探针进行特异性的筛选，最终以151位T/C位点设计的探针构建了中药材薄荷与留兰香的鉴定体系。本专利技术用分子生物学技术针对薄荷和留兰香药材混用以及相互掺杂问题建立快速检测鉴别方法，为薄荷与留兰香的临床用药安全和市场监管提供了强有力的技术支持。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于提供一种能快速简捷、稳定可靠鉴定中药材薄荷及其常见混伪品留兰香的MLPA探针组。在此基础上，本专利技术进一步提供一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术使用的技术方案如下：
[0007]一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA探针组，它由针对薄荷与留兰香的核基因组ITS2序列差异位点设计的两条右探针(Right Probe Oligonucleotide,RPO)和一条共同左探针(Left Probe Oligonucleotide,LPO)组成，各探针的序列如下：
[0008]薄荷右探针B
‑
RPO：5
’‑
TCGTGGTCGTGCCGCCGTGTCGTCCCTATATTCTAGATT GGATCTTGCTGGCAC
‑3’
(SEQ ID NO:1)
[0009]留兰香右探针L
‑
RPO：5
’‑
CTCGCAGCCGTGCCGCCGTGCCGTCCCGTAGTCGTCT AGATTGGATCTTGCTGGCAC
‑3’
(SEQ ID NO:2)
[0010]共同左探针LPO：5
’‑
GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGACAAGTGGTGGTTGAACAT CTCAATCTCTC
‑3’
(SEQ ID NO:3)。
[0011]本专利技术所提供的探针组包含三个探针，它们在使用时是同时加入而非拆分。
[0012]所述探针组中，薄荷右探针与留兰香右探针的摩尔比为1
‑
5:1，优选为2
‑
2.5:1。另外，探针组中的左、右探针按常规比例，通常为1:1。
[0013]利用本专利技术提供的探针组，结合MLPA技术即可实现中药材薄荷及其常见混伪品留兰香的快速鉴定，鉴定过程中无需对扩增产物进行测序，仅将ITS2序列与MLPA探针进行杂交、连接并进行荧光定量PCR扩增即可，本专利技术不仅能区分鉴别薄荷、留兰香，而且能对掺伪的混合样品进行检测，从而能更有效地进行市场监管，确保临床用药的有效性。
[0014]本专利技术进一步提供了一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA方法，包括以下步骤：
[0015]1)提取样品基因组DNA；
[0016]2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增核基因组ITS2序列并进行纯化；
[0017]3)将纯化的扩增产物变性后与所述的MLPA探针组进行杂交；
[0018]4)用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物连接；
[0019]5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行荧光定量PCR扩增；
[0020]6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。
[0021]优选地，所述杂交的温度是70℃。
[0022]优选地，所述连接的温度是45℃，时间15min。
[0023]优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为95℃1min；95℃10s，60℃5s，72℃15s，33个循环；72℃5min。
[0024]其中，用于PCR扩增核基因组ITS2序列的引物是本领域所熟知的植物ITS2序列通用引物ITS2F/3R，序列如下：
[0025]上游引物:5
’‑
ATGCGATACTTGGTGTGAAT
‑3’
[0026]下游引物:5
’‑
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
‑3’
。
[0027]其中，所述DNA连接酶为9
°
N
TM
DNA Ligase，用于连接左、右探针。
[0028]其中，用于进行荧光定量PCR扩增的引物是本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA探针组，其特征在于，所述MLPA探针组由针对薄荷与留兰香的核基因组ITS2序列差异位点设计的两条右探针和一条共同左探针组成，各探针的序列如下：薄荷右探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；留兰香右探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；共同左探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.如权利要求1所述鉴定薄荷与留兰香的的MLPA探针组，其特征在于：所述薄荷右探针与所述留兰香右探针的摩尔比为1
‑
5:1。3.如权利要求2所述鉴定薄荷与留兰香的的MLPA探针组，其特征在于：所述薄荷右探针与所述留兰香右探针的摩尔比为2
‑
2.5:1。4.权利要求1
‑
3任一项所述的MLPA探针组在鉴定薄荷与留兰香中的应用。5.一种鉴定薄荷与留兰香的MLPA方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增核基因组ITS2序列并进行纯化；3)将纯化的扩增产物变性后与权利要求1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，胡敏，李小芳，覃桂，程华春，莫静，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：