一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA探针组及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA探针组，所有探针组由三条左探针和一条共同右探针组成，所述三条左探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA探针组及方法


[0001]本专利技术属于中药材鉴定领域，具体涉及一种快速鉴别中药材羚羊角及其代用品的MLPA探针，本专利技术还涉及一种快速鉴别中药材羚羊角及其代用品的MLPA方法。

技术介绍

[0002]羚羊角(Saigae Tataricae Cornu)为牛科动物赛加羚羊(Saiga tatarica Linnaeus)的角，其具有突出的抗炎、解热镇痛、抗惊厥作用及理想的降压作用，在临床上用于肝风内动、惊痫抽搐、癫痫发狂、头痛眩晕、高热痉厥、妊娠子痫、痈肿疮毒等症，具有较高的药用价值。近年来，赛加羚羊野生资源逐渐减少，被列入世界濒危动物红色名录，且标注为极濒危类目。由于羚羊角货源短缺、市场价格居高不下，不法商家有意造假以牟取利益，造成羚羊角贸易混乱、用药错误等问题。羚羊角常见伪品主要有水牛(Bubalusbubalis)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)、黄羊(Procapra gutturosa)等动物的角，甚至在民间被作为羚羊角代用品使用。羚羊角通常以粉末、条状或切片销售，难以通过肉眼鉴别，而显微观察以及薄层鉴别等方法操作复杂且受主观经验和环境影响较大。因此，需要一种有效、准确的羚羊角药材及其常见伪品的鉴别方法，以确保用药安全，同时对于监控赛加羚羊等濒危物种的盗猎和走私活动也具有重要意义。
[0003]多重连接探针扩增技术(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,MLPA)是一种新的核酸检测技术，该方法结合DNA探针杂交和PCR扩增技术的特点，可以实现对待检DNA序列的定性。通过样品DNA变性，杂交反应，连接反应，PCR扩增四个步骤实现在同一反应体系中完成多达50个不同DNA序列的检测。该方法核心在于用连接酶将与靶序列杂交的左探针和右探针连接成含通用引物的全长探针，每个探针扩增产物的长度和熔解温度唯一，可通过毛细管电泳分离或其熔解温度差异区分开。MLPA方法有诸多优点，比如：对模板DNA质量要求低，总量要求少，仅需要研究物种杂交片段遗传信息存在差异即可；MLPA方法用一对通用引物扩增多个物种的探针连接产物序列，避免了不同引物扩增效率差异导致的误差。目前，该技术已应用于临床诊断、病毒检测、食物中过敏原和转基因成分的检测及中药材鉴定等多个领域。本专利技术与传统MLPA相比，缩短了探针与靶序列杂交的时间并应用了连接效率更高的连接酶，从而实现明显缩短样品检测周期的目的。同时，将该方法与熔解曲线结合，能够通过观测熔解曲线Tm值，实现在短时间对样品的鉴别。目前还没有采用MLPA结合熔解曲线的方法对中药材羚羊角进行鉴别的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术采用MLPA结合熔解曲线的方法，针对中药材羚羊角及其常见伪品的COI序列设计特异性MLPA探针，并且建立一种鉴别羚羊角药材及其代用品的方法，该方法具有特异性强、准确性高、快速便捷等优点。
[0005]为实现第一个目的，本专利技术提供一种鉴别羚羊角及其代用品的MLPA探针，所述探针共4条，由三条左探针和一条右探针组成，探针序列如下：
[0006]羚羊角左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCTATTTGTATGATCTGTCCTAATTACGGCTGTC(SEQ ID NO:1)；
[0007]绵羊/山羊角左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTATAATTATGTGTGATCCGTCATAATTACCGCCGTA(SEQ ID NO:2)；
[0008]黄羊/水牛角左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTGGCCGCGTGTGATCCGTAATAATTACCGCCGTG(SEQ ID NO:3)；
[0009]共同右探针：CTCCTACTCCTTTCACTTCCCGTACTAGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC(SEQ ID NO:4)；
[0010]其中，由羚羊角左探针和共同右探针组成的探针组，可单独用于鉴定羚羊角；由绵羊/山羊角左探针和共同右探针组成的探针组，可单独用于鉴定绵羊角/山羊角；由黄羊/水牛角左探针和共同右探针组成的探针组，可单独用于鉴定黄羊角/水牛角。
[0011]其中，由三条左探针和共同右探针组成的混合体系，可用于羚羊角、绵羊/山羊角、黄羊/水牛角的单独鉴定以及掺伪羚羊角样品的鉴定。在进行未知样品鉴时，所述MLPA探针组需混合使用而非拆分。
[0012]为实现第二个目的，本专利技术提供一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA方法，该方法包括以下步骤：
[0013]1)提取样品基因组DNA；
[0014]2)以提取的基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增样品COI序列并纯化扩增产物；
[0015]3)将扩增产物变性后与以上所述的MLPA探针组杂交；
[0016]4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；
[0017]5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行荧光定量PCR扩增；
[0018]6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。
[0019]优选地，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5、6所示。
[0020]优选地，所述杂交的温度是65℃，时间20min。
[0021]优选地，所述连接的温度是45℃，时间15min。
[0022]优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应循环数是35。
[0023]优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为2
×
T5 Fast qPCR Mix 10μL，10μM上游通用引物0.8μL，10μM下游通用引物0.8μL，50
×
ROX Reference Dye I 0.4μL，连接产物5μL，ddH2O 3μL。
[0024]优选地，所述MLPA探针组中，三条左探针的体积比为2：3：1。
[0025]通过观测样品熔解曲线峰和Tm值判断结果，若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为80.7℃
±
0.2℃，则为羚羊角；若样品出现单一熔解峰且Tm值为78.9℃
±
0.2℃，则为绵羊角或山羊角；若样品出现单一熔解峰且Tm值为82.3℃
±
0.2℃，则为黄羊角或水牛角；若样品出现两个或三个相应Tm值的熔解曲线峰，则为混合样品。
[0026]本专利技术的有益效果是：
[0027]本专利技术能够在较短的时间内快速鉴别中药材羚羊角，并可有效检测出羚羊角掺混样品，判断出羚羊角中是否掺混了绵羊角/山羊角、黄羊角/水牛角。本专利技术还可用于绵羊
角/山羊角、黄羊角/水牛角的单独鉴定。该方法具有特异性强，灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。
附图说明
[0028]图1是羚羊角特异性探针与不同模板DNA反应的扩增曲线图谱。
[0029]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA探针组，其特征在于：所有探针组由三条左探针和一条共同右探针组成，所述三条左探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示，所述共同右探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述羚羊角代用品为绵羊角、山羊角、黄羊角、水牛角。2.权利要求1所述的MLPA探针组在鉴定中药材羚羊角及其代用品中的应用。3.一种鉴定中药材羚羊角及其代用品的MLPA方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以提取的基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增样品COI序列并纯化扩增产物；3)将扩增产物变性后与权利要求1所述的MLPA探针组杂交；4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行荧光定量PCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。4.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于：所述特异性引物包括上游引物和下游引物，引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示。5.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于：所述杂交的温度是65℃，时间20min。6.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，胡敏，莫静，徐玲，程华春，覃桂，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：