一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物、试剂盒及方法，属于生物化学与分子生物学领域。该PCR引物为：BCITS

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli，B.coli)属于纤毛虫门、动基裂纲、毛口目、小袋虫科、小袋虫属，1857年首次从人体的粪便中发现该虫体。B.coli发育的过程中有滋养体和包囊两个时期。滋养体主要以横二分裂法增殖，分泌透明质酸酶通过机械运动侵入肠壁，导致动物机体腹泻、结肠充血、出血、溃疡和穿孔等，是一种水源性呈世界性分布的，寄生在动物肠道的人畜共患原虫病，目前认为猪是主要的传播源，主要流行于热带和亚热带地区，可感染包括人在内的30多种动物，如猪、猩猩、猴、马、羊、等均可感染。人感染后可造成肠道溃疡，甚至可转移至呼吸道、尿生殖道、盆腔等部位寄生，造成坏死性肺、尿道感染、子宫阴道炎症、膀胱炎等。
[0003]我国已有20多个省市出现感染结肠小袋纤毛虫，感染和分布有扩大的趋势，通过大量的数据表明，动物机体感染结肠小袋纤毛虫后可使自身免疫力下降，导致结肠小袋纤毛虫的大量繁殖，造成饲料的转化率下降，并且容易继发细菌或病毒感染，加重病情，严重时可致动物死亡，并传播感染其他动物，给养殖业造成一定的经济损失。
[0004]小袋属纤毛虫所感染的宿主种类多，分离不同宿主源虫体并通过基于核糖体小亚基18S rRNA等遗传标记基因的序列分析，确定其分类地位，核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)，位于18S和26S rRNA基因之间，被5.8S rRNA基因分为ITS1和ITS2两段，ITS序列具有较好的PCR扩增效率和测序成功率，同时具有较大的种间变异和较小的种内变异，适用于结肠小袋纤毛虫的种内或者不同分离株间的基因分型。人源、大猩猩源、猪源和鸵鸟源结肠小袋纤毛虫的ITS序列进行比对分析发现，结肠小袋纤毛虫分为A、B、C三个基因型，不同基因型在致病性上可能存在差异，结肠小袋纤毛虫三种基因型的确切致病性需要用动物感染试验进一步验证。不同基因型滋养体和包囊形态结构非常相似，仅靠显微镜观察很难辨别，因此，准确检测宿主体内和环境水样中结肠小袋纤毛虫的基因型或强致病虫株，科学进行风险性评估，必须依靠分子生物学技术，对不同宿主进行结肠小袋纤毛虫分子流行病学调查，揭示该病分子传播机制，对防控人和动物结肠小袋纤毛虫病爆发具有重要的指导意义。

技术实现思路

[0005]针对以上问题，本专利技术提供一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物，并构建试剂盒，能够简便、高效地鉴定结肠小袋纤毛虫不同分离株间的基因分型。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物，包括以下PCR引物：
[0008]BCITS
‑
F：CCATATCGATGAAGAACGC；
[0009]BCITS
‑
R：AGGTGCAAATTAAAATTGTCT。
[0010]作为技术方案的优选，所述PCR引物扩增片段为ITS基因，扩增长度为232bp。
[0011]一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的PCR引物。
[0012]一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的方法，所述方法采用如上所述的PCR引物鉴定结肠小袋纤毛虫基因型。
[0013]本专利技术的鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的方法，包括以下步骤：
[0014](1)提取待检样品的DNA；
[0015](2)PCR反应体系建立：以每25μl体积的PCR反应体系为计，
[0016][0017](3)对待检样品进行PCR反应检测；
[0018](4)对PCR扩增产物进行电泳及测序。
[0019]作为技术方案的优选，所述提取待检样品的DNA为按照粪便基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA。
[0020]作为技术方案的优选，所述提取待检样品的DNA的具体操作步骤为：
[0021]①
取100
‑
300mg离体粪便样本，置于离心管中，加入1mL Buffer SW，涡旋振荡3
‑
5min使样本均匀分散于溶液中，再以12000rpm的转速离心1min，弃掉上清液；
[0022]②
往离心管中加入1mL Buffer SL，涡旋振荡3
‑
5min使样本均匀分散于溶液中，置于65℃水浴中20min并每隔5min涡旋振荡15s，然后以12000rpm的转速离心5min，将上清液移至干净的离心管中；
[0023]③
向步骤
②
得到的上清液中加入等体积的Buffer GL，颠倒混匀15
‑
25次，然后置于冰上放置5min，再以12000rpm的转速离心5min，保留上清液；
[0024]④
将吸附柱装入收集管中，然后将步骤
③
得到的上清液加入吸附柱中，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；
[0025]⑤
向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；
[0026]⑥
向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；
[0027]⑦
重复步骤
⑥
；
[0028]⑧
以12000rpm的转速离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温下晾干；
[0029]⑨
将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50
‑
100μL BufferGE，室温放置2
‑
5min，再以12000rpm的转速离心1min，即得到DNA溶液。
[0030]作为技术方案的优选，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，43
‑
52℃退火30s，72℃延伸30s；如此循环35次后，72℃再延伸10min。
[0031]作为技术方案的优选，所述PCR反应的最佳退火温度为46
‑
48℃。
[0032]作为技术方案的优选，将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将有目的条带的PCR扩增产物进行胶回收、克隆和测序，准确后进行提取质粒。
[0033]本专利技术根据GeneBank中已经发表的结肠小袋纤毛虫序列，选定其中的ITS基因，设计并合成一对特异性引物(BCITS
‑
F、BCITS
‑
R)，以结肠小袋纤毛虫的D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物，其特征在于，包括以下PCR引物：BCITS
‑
F：CCATATCGATGAAGAACGC；BCITS
‑
R：AGGTGCAAATTAAAATTGTCT。2.根据权利要求1所述的鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物扩增片段为ITS基因，扩增长度为232bp。3.一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的PCR引物。4.一种鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1或2所述的PCR引物鉴定结肠小袋纤毛虫基因型。5.根据权利要求4所述的鉴定结肠小袋纤毛虫基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检样品的DNA；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺会利，谢永平，庞彬辉，介百飞，袁翠平，冯世文，禤雄标，彭昊，李军，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：