本发明专利技术公开了一种基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒包含：正向引物1序列为如SEQ ID No.1所示；反向引物1序列如SEQ ID No.2所示；探针1序列如SEQ ID No.3所示；正向引物2序列如SEQ ID No.4所示；反向引物2序列如SEQ ID No.5所示；探针2序列如SEQ ID No.6所示。本发明专利技术的引物探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，实现非靶向8种动物源性成分检测，可以进行马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述8种常见动物源性。常见动物源性。常见动物源性。
【技术实现步骤摘要】
基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒
[0001]本专利技术属于食品检测
，尤其涉及非靶向动物源性检测领域。
技术介绍
[0002]动物产品是人们赖以生存的物质基础。不同动物产品价格的巨大差异驱使一些不法商贩和企业在生产、加工、流通及餐饮中造假掺假。动物产品真实性分析的国家、行业以及地方标准集中在实时荧光PCR技术。然而，目前基于实时荧光PCR技术的动物产品真实性分析技术都是靶向分析。广泛存在的动物产品造假掺假的欺诈违法行为以及不明源性成分的快速检测需求期待非靶向分析技术。目前，非靶向分析技术只集中在DNA测序技术。但是，检测时间长、试剂耗材成本高以及测序仪普及程度低等原因成为测序技术在食品安全检测中广泛应用的掣肘。
技术实现思路
[0003]本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的8种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合及试剂盒，解决动物产品中非靶向动物源性检测的技术瓶颈，实现不确定成分的样品源性检测。
[0004]本专利技术的技术方案为：非靶向8种动物源性检测的引物探针组合，包含：
[0005]正向引物1序列为：TAAATAGGHGAVGGTTTHGAAGA(如SEQ ID No.1)所示；
[0006]反向引物1序列为：TCATTRRKGTTCTTRTAGTTGAA(如SEQ ID No.2)所示；
[0007]探针1序列为：TGACATGAAAAATCATCGTTGTA(如SEQ ID No.3)所示；/>[0008]正向引物2序列为：CAAAAGGCTTAAGCCCTTT(如SEQ ID No.4)所示；
[0009]反向引物2序列为：ACGGCRATYARGATKGG(如SEQ ID No.5)所示；
[0010]探针2序列为：CCAGAGGTTCAAATCCTCTC(如SEQ ID No.6)所示。
[0011]进一步地，探针1和2序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。
[0012]进一步地，探针1的5'端修饰有HEX，3'端修饰有MGB，探针2的5'端修饰有ROX，3'端修饰有MGB。
[0013]非靶向8种动物源性检测的试剂盒，试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物和探针。
[0014]进一步地，所述试剂盒还含有以下a或b中的一种或多种：
[0015]a、Probe qPCR预混液；
[0016]b、马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品。
[0017]动物产品中8种常见动物源性的非靶向检测的方法，步骤如下：
[0018](1)提取动物产品(肉制品和乳制品)的DNA；
[0019](2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针进行
荧光定量PCR扩增，利用马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
[0020](3)Real
‑
time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
[0021]进一步地，Real
‑
time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的正向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的反向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的探针1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.4所示的正向引物2 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.5所示的反向引物2 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.6所示的探针2 0.5μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水5μL，总体积20μL。
[0022]进一步地，Real
‑
time PCR反应程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火延伸31s，40个循环。
[0023]本专利技术通过比对马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅、绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿、兔及狗等17种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种之间的保守和序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100
‑
150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，并且中间特异序列在上述8个物种之间是保守的。两端保守的位置设计引物(兼并引物)，中间特异的位置设计马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪等5种物种以及鸡、鸭、鹅等3种物种的复合探针1和2。引物和探针的退火温度控制在55
‑
60℃和65
‑
70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的源性检测。
[0024]本专利技术研发了基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物和探针及试剂盒。在此过程中实现了同一PCR反应体系同时检测8种动物源性成分。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0026]本专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现非靶向8种动物源性成分检测，可以进行马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述8种常见动物源性。
附图说明
[0027]图1利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，马肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出马源性。
[0028]图2利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，驴肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出驴源性。
[0029]图3利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.非靶向8种动物源性检测的引物探针组合，其特征在于，包含：正向引物1序列为如SEQ ID No.1所示；反向引物1序列如SEQ ID No.2所示；探针1序列如SEQ ID No.3所示；正向引物2序列如SEQ ID No.4所示；反向引物2序列如SEQ ID No.5所示；探针2序列如SEQ ID No.6所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针1和2序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针1的5'端修饰有HEX，3'端修饰有MGB，探针2的5'端修饰有ROX，3'端修饰有MGB。4.非靶向8种动物源性检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物和探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有以下a或b中的一种或多种：a、Probe qPCR预混液；b、马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品。6.动物产品中8种常见动物源性的非靶向检测的方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取动物产品(肉制品和乳制品)的DNA；(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，利用马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭梁，刘国强，呼日，李春冬，徐伟良，牛慧敏，木其勒，
申请(专利权)人：锡林郭勒职业学院，
类型：发明
国别省市：
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