沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体核酸联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体核酸联合检测试剂盒。具体而言，本发明专利技术的试剂盒采用沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体的特异性引物和探针，利用反转录酶将mRNA逆转录为DNA后，同步测定病原体的DNA和RNA，而且，本发明专利技术的试剂盒在核酸提取和扩增过程中加入外源性内控酵母细胞，可全程监控核酸提取和扩增过程，防止假阴性的结果。防止假阴性的结果。

【技术实现步骤摘要】
沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体核酸联合检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体核酸联合检测试剂盒。具体而言，本专利技术涉及使用多重荧光PCR扩增体系，以高特异性地、高灵敏度地针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和解脲脲原体进行检测的多重检测体系。

技术介绍

[0002]性传播疾病主要由病毒、细菌、衣原体、支原体等引起，主要通过性接触在人群中传染，其次有些还可以通过间接接触、血液或母婴传播。性传播疾病可以对人的身体造成较大危害，无症状或症状不明显导致长期携带不能及时被诊断、治疗时，会导致各种并发症及后遗症，其发病率呈逐年升高的趋势。
[0003]沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)和解脲脲原体(UU)这三种病原体常常引起类似的泌尿生殖道感染症状。泌尿科的临床研究结果显示，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和解脲脲原体的感染者一般会发生泌尿生殖系统症状，但仍有部分人存在无明显症状的携带感染。
[0004]沙眼衣原体的无症状携带易造成上行感染，如男性的附睾炎，女性的子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎，并且传染给其性伴侣。男性无症状人群的沙眼衣原体检出率为4.4％左右。淋病奈瑟菌通常引起尿道炎和排尿困难，无症状的人携带率仅为0.4％。解脲脲原体的携带率较高，男性为22％左右，女性高于男性，为48％左右。其致病性与其血清型相关，可在一定条件下导致非淋菌性尿道炎、宫颈炎、不孕不育症等。其致病性与宿主的免疫力也有关系。
[0005]沙眼衣原体是一类革兰氏阴性菌，须寄生于真核细胞，以获得代谢所需的能量ATP。能感染人的主要是沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型两种。其中沙眼生物型根据其外膜蛋白OMP1的多态性，可以分为A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K共14种血清型，其中D
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K型为感染生殖器官相关的血清型。人感染后沙眼衣原体后可导致的疾病包括沙眼、包膜炎、泌尿生殖道感染以及非淋性尿道炎等。少部分成年人感染后病情隐匿，母亲孕期感染后多无明显症状，如不及时治疗，不但可造成不孕、异位妊娠、早产、流产、死胎等，还可在孕期或分娩时造成胎儿感染，且分娩后又可通过密切接触传播给婴儿。沙眼衣原体感染主要引起新生儿包涵体结膜炎、婴儿肺炎，部分病原体可通过泪腺进入鼻咽部及下呼吸道，导致婴幼儿发生慢性肺部炎症。
[0006]淋病奈瑟菌，俗称淋球菌，常导致人急性尿道炎或阴道炎，俗称淋病。淋球菌主要侵犯人类泌尿生殖道的柱状上皮细胞，也可以由尿道和宫颈进一步扩散，导致附睾炎、前列腺炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎等。部分携带者甚至无临床症状，从而导致性病的进一步传播。近年来淋病发病例数在我国呈上升趋势。由于抗生素的大量使用，某些淋病奈瑟菌获得了耐药性质粒，从而对药物治疗产生了抗性，其耐药性主要包括青霉素类、喹诺酮类和四环素类。WHO根据其菌株首次报道来源及其基因序列的特异性，确定了WHO A
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V菌株。如WHO M(菲律宾)、WHO O(加拿大)和WHO N(澳大利亚)都含有青霉素抗性质粒片段，表达β内酰胺酶；而WHO K(日本)由于含有嵌合penA基因、WHO L(亚洲)具有点突变(A501V)的penA基
因，WHO G(泰国)、WHO P(美国)的penA移码突变，也获得了耐受低浓度青霉素和头孢类抗生素的能力；WHO G和WHO N含有四环素抗性质粒片段(tetM)。因某些淋病的初期症状不显著加上其耐药性，容易导致患者对性传播疾病的忽视或者治疗效果反复。因此，淋病奈瑟菌的早期检出有利于帮助人们正确用药，避免因错误用药而导致病情的反复。
[0007]解脲脲原体是一种介于细菌和病毒之间的原核微生物，没有细胞壁，是目前发现的能够在无机培养基上生长和繁殖的最小微生物。解脲脲原体是泌尿生殖道常见的微生物，女性携带高于男性。在成年女性生殖道中的定植率为40
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80％，且妊娠期较高，作为一种条件致病菌存在。临床统计结果显示，解脲脲原体可以在一定条件下导致非淋性尿道炎、孕妇早产及绒毛膜炎症、新生儿肺部感染、不孕等临床症状。解脲脲原体根据其Multi
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banded protein(MBP)基因的多态性可以分类两类，一类是生物一群，也叫做parvo、微小脲原体，包括血清型1、3、6、14；另一类是生物二群，T960，包括2、4、5、7
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13。解脲脲原体的检出对于提高妇女的生殖健康有积极作用，可以帮助育龄妇女提高对于解脲脲原体的检测和预防效果疾病，从而避免对胎儿和新生儿产生不必要的感染，为优生优育提供保障。
[0008]目前市场上针对沙眼衣原体的检测方法主要分为两类，一类是免疫法，主要检测人血清中沙眼衣原体抗体或者检测分泌物拭子样本中的沙眼衣原体抗原；一类是分子方法，以PCR荧光探针法或者其他方法检测人分泌物拭子样本中的沙眼衣原体的DNA。针对淋病奈瑟菌的检测方法有三类，一类是传统的培养法，用于淋病奈瑟菌的分离培养；第二类是免疫法，主要检测分泌物拭子样本中的淋病奈瑟菌抗原；第三类是目前快速发展的分子检测，以PCR
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荧光探针法为主流，检测人分泌物拭子样本中的淋病奈瑟菌的DNA。针对解脲脲原体的检测方法也有三类，一类是传统的培养法，用于解脲脲原体的分离培养；第二类是免疫法，主要检测人血清样本中的解脲脲原体抗体；第三类是目前快速发展的分子检测，以PCR
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荧光探针法为主流，检测人分泌物拭子样本中的解脲脲原体的DNA。
[0009]可见，目前市场上针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和解脲脲原体的检测方法主要包括培养法、免疫法和基于核酸的PCR方法。培养法操作繁琐、测试时间较长，不适于大范围检测。免疫法的灵敏度和特异性受限且存在窗口期。聚合酶链式反应(PCR)法经过逐步的发展，已显示了其在检测上的优势。然而，如上所述，现有技术的PCR方法中，大部分是检测样本中病原体的DNA。
[0010]实时荧光PCR技术是在核酸反应管中加入一对引物的同时加入一种特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；扩增反应开始后，探针结合在目标DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5
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外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR技术是一种灵敏度、特异性和精密度更高的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能及时反映病原体的变化，同时避免了传统PCR需后处理的问题，降低了污染的可能性。
[0011]多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。影响多重PCR的因素包括引物特异性及其之间的相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体联合检测试剂盒，其为PCR
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荧光探针联合检测试剂盒，其特征在于其同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体的DNA和RNA。2.根据权利要求1所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体联合检测试剂盒，其还包含外源内控，优选地，所述外源内控选自酵母菌。3.根据权利要求1或2所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体联合检测试剂盒，其中PCR
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荧光探针所针对的沙眼衣原体的靶基因选自胰岛素酶家族蛋白基因TncL2基因，优选地，如SEQ ID No.13或18所示的序列，和/或PCR
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荧光探针所针对的淋病奈瑟菌的靶基因选自假定蛋白基因，优选地，如SEQ ID No.14或19所示的序列，和/或PCR
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荧光探针所针对的解脲脲原体的靶基因选自UreD基因，优选地，如SEQ ID No.15或16所示的序列。4.根据权利要求2或3所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体联合检测试剂盒，其中PCR
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荧光探针所针对的外源内控的靶基因选自YRA1基因，优选地，如SEQ ID No.17所示的序列。5.根据权利要求2
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4任一项所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌及解脲脲原体联合检测试剂盒，其中针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体及外源内控的靶基因的探针在5
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端分别用选自6
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FAM、HEX/VIC、ROX及Cy5之一的报告基团标记，且在3
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端分别用选自BHQ1及BHQ2的淬灭基团标记，优选地，沙眼衣原体的报告基团为5
’6‑
FAM，淬灭基团为3
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BHQ1，淋病奈瑟菌的报告基团为5
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HEX/VIC，淬灭基团为3
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BHQ1，解脲脲原体的报告基团为5
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ROX，淬灭基团为3
’‑
BHQ2，外源内控酵母的报告基团为5
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨星，殷珂，徐敏，
申请(专利权)人：嘉兴市艾科诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：