本发明专利技术提供了一种用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中包括针对艰难梭菌的TPI、tcdA和tcdB基因设计的引物和探针组合。本发明专利技术还提供了使用该试剂盒的方法，以及该试剂盒的用途。本发明专利技术提供的试剂盒和方法能够快速准确地检测目标细菌，特异性良好，在极大提高检测灵敏度和检测效率的同时还降低了检测成本。本。本。
【技术实现步骤摘要】
高效检测艰难梭菌的多重荧光试剂盒、引物探针组合及其用途
[0001]本专利技术涉及生物技术和分子诊断领域，具体涉及高效检测艰难梭菌的多重荧光试剂盒、引物探针组合及其用途。
技术介绍
[0002]条件致病菌，又称为机会性致病菌，是指原来不致病的正常菌群中的细菌，在某些特定条件下，正常菌群与宿主、正常菌群之间，通过营养竞争、代谢产物的相互制约等因素维持的良好生存平衡关系被打破，例如免疫系统受损或疾病状态下，引起感染和疾病，成为致病菌的一类细菌，其常见种类包括葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌等。特别是在医疗机构和食品加工业中，条件致病菌常会引发感染、食品中毒、药物耐药性等危害，是导致医院感染和食源性疾病的主要原因之一。
[0003]艰难梭菌(Clostridium difficile，CD)是一种专性厌氧革兰阳性芽孢菌，也是一种条件致病菌，主要定植于人和动物的胃肠道中，并可产生毒素，引起厌食、腹泻、腹痛或干扰胃肠道菌群平衡等症状。在免疫系统受损或存在其他疾病的人群中，艰难梭菌还可能引起肠道感染、肺炎、败血症等严重疾病，甚至导致死亡。
[0004]艰难梭菌分为产毒型和非产毒型，其中产毒型菌株能够产生多种毒素，包括A、B、C、D、E和F六种类型。其中毒素A(tcdA)和毒素B(tcdB)是最为常见和最具毒性的两种毒素。tcdA与tcdB分别为肠毒素与细胞毒素，都是由艰难梭菌菌株在一定条件下分泌的外毒素，二者会对人的肠道黏膜和神经系统产生毒性作用，通过破坏肠黏膜的完整性导致疾病的发生，感染时可出现腹泻和假膜性结肠炎，引发严重的食源性疾病。因此，对于食品安全来说，同时检测艰难梭菌和艰难梭菌毒素基因尤为重要，以确保食品无菌和无毒。
[0005]近年来，由于高毒力株NAP1/RT027/BI的出现，艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)呈现出高发病率与高死亡率态势。CDI的临床表现非常不同，从无症状携带者状态，轻度或中度腹泻，到危及生命的暴发性结肠炎。然而，CD已对多种抗生素表现出耐药性，同时当前的分子流行病学研究数据表明我国CDI流行病学特征具有菌株分型呈现显著多样性的自身特点，因此快速而准确地诊断CDI，及时采取有效的预防和治疗措施，对阻止病原菌的传播、改善患者预后状况及节省国家医疗支出具有重要意义。
[0006]针对不同的检测目标，CDI的检测方法有多种。检测粪便中的游离毒素的方法有酶免疫测定法(EIA)和粪便细胞毒性测定法(CTA)；测定艰难梭菌的特异抗原有EIA方法测谷氨酸脱氢酶(GDH)；检测产毒艰难梭菌的方法有产毒艰难梭菌培养(TC)和核酸扩增试验(NAAT)。其中，NAAT方法是基于实时荧光PCR、环介导等温扩增技术或微阵列技术等分子检测技术进行的艰难梭菌检测。
[0007]NAATs检测的靶基因种类很多，包括tcdA、tcdB以及tcdC基因或二元毒素(cdtA/B)基因。NAATs方法非常敏感，具有较高的阴性预测值。而且其检测速度较快，可以在一小时内得到结果，因此常把它作为CDI筛选试验。然而，NAATs方法仍存在潜在问题，如由于基因变
异，tcdB或tcdA基因片段可能导致假阴性。而使用tcdC作为对高产毒株型艰难梭菌的特异性检测位点，也存在一定争议。市场现有的高产毒艰难类梭菌诊断试剂盒费用相对较为昂贵，不适用于临床CDI的大规模筛查或实验室的大批量艰难梭菌检测。与此同时，由于艰难梭菌可以处于定植状态或感染状态，在样品中检测到它们的限制较大。在定植状态下，艰难梭菌可能对宿主无害，因此在特定人群或动物样本中即使检测到它们，未必表示存在感染或食品安全问题；在感染状态下，艰难梭菌的生长环境严苛且对环境影响较强，检测其菌落并鉴定出准确菌株易受到其他菌株干扰影响而存在难度。因此，迫切需要选择出针对我国CDI中艰难梭菌分型特点的特异性基因序列，设计优化新的引物和探针组合，提高检测灵敏度和特异性，防止误检漏检的发生，开发高效准确、经济适用的艰难梭菌检测试剂盒。
技术实现思路
[0008]鉴于现有技术的不足和生物技术的发展，本专利技术旨在提供一种基于多重实时PCR
‑
荧光探针法联合对艰难梭菌及两种毒素编码基因进行定性检测的试剂盒。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]在本专利技术的一个方面，提供一种用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，包括：分别针对艰难梭菌TPI、tcdA、和tcdB靶基因的引物和探针组合。
[0011]优选的，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述靶基因为如SEQ ID No：1所示的TPI基因、如SEQ ID No：2所示的tcdA基因、和如SEQ ID No：3所示的tcdB基因。
[0012]优选的，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、选自如SEQ ID No：7、8和18所示的序列组合或如SEQ ID No：9、10和19所示的序列组合、和选自如SEQ ID No：11、12和20所示的序列组合或如SEQ ID No：13、14和21所示的序列组合。
[0013]优选的，在一个实施方案中，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、如SEQ ID No：7、8和18所示的序列组合和如SEQ ID No：11、12和20所示的序列组合。
[0014]更优选的，在一个实施方案中，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、选自如SEQ ID No：7、8和18所示的序列组合、和如SEQ ID No：13、14和21所示的序列组合。
[0015]更优选的，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、如SEQ ID No：9、10和19所示的序列组合、和如SEQ ID No：11、12和20所示的序列组合。
[0016]更加优选的，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、如SEQ ID No：9、10和19所示的序列组合、和如SEQ ID No：13、14和21所示的序列组合。
[0017]另一方面，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒中还包括针对外源内控基因的引物和探针组合，所述外源内控基因为酿酒酵母YRA1基因。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
[0018]优选的，本专利技术所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒中所述针对YRA1
基因的引物和探针组合是如SEQ ID No：15、16和22所示的序列组合。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：分别针对艰难梭菌TPI、tcdA、和tcdB靶基因的引物和探针组合。2.如权利要求1所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述靶基因为如SEQ ID No：1所示的TPI基因、如SEQ ID No：2所示的tcdA基因、和如SEQ ID No：3所示的tcdB基因。3.如权利要求1所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、选自如SEQ ID No：7、8和18所示的序列组合或如SEQ ID No：9、10和19所示的序列组合、和选自如SEQ ID No：11、12和20所示的序列组合或如SEQ ID No：13、14和21所示的序列组合。4.如权利要求3所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中还包括针对外源内控基因的引物和探针组合，所述外源内控基因为酿酒酵母YRA1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。5.如权利要求4所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其中所述针对YRA1基因的引物和探针组合是如SEQ ID No：15、16和22所示的序列组合。6.如权利要求5所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述TPI探针5'端标记6
‑
FAM荧光基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团；所述tcdA探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团；所述tcdB探针5'端标记ROX荧光基团，3'端标记BHQ2荧光淬灭基团；所述YRA1探针5'端标记Cy5荧光基团，3'端标记BHQ2荧光淬灭基团。7.如权利要求1
‑
6之任一项所述的用于检测艰难梭菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒适配DXcellence
TM
全自动核酸检测分析仪系统或ABI 7500实时荧光PCR仪，并包括试剂盒说明书。8.用于检测艰难梭菌的特异性引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合为如SEQ ID No：5、6和17所示的序列组合、选自如SEQ ID No：7、8和18所示的序列组合或如SEQ ID No：9、10和19所示的序列组合、和选自如SEQ ID No：11、12和20所示的序列组合或如SEQ ID No：13、14和21所示的序列组合。9.如权利要求8所述的用于检测艰难梭菌的特异性引物和探针组合，其中还包括针对外源内控YRA1基因的引物和探针组合，是如SEQ ID No：15、16和22所示的序列组合。10.如权利要求9所述的用于检测艰难梭菌的特异性引物和探针组合，其中所述TPI探针5'端标记6
‑
FAM荧光基...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨星，殷珂，夏泽，
申请(专利权)人：嘉兴市艾科诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。