一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法，它包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增核基因片段；3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；4)利用DNA连接酶将杂交产物进行连接；5)利用通用引物对连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。本发明专利技术能够在较短的时间内鉴别石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲，可有效检测出掺混样品，该方法具有特异性强，灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。的应用前景。的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法


[0001]本专利技术属于中药材鉴定领域，具体涉及一种基于多重连接探针扩增技术快速鉴别石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的方法。

技术介绍

[0002]药材市场上菖蒲类药材有石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲三种。石菖蒲为常用野生中药材品种之一，其基原物种为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott(Flora of China收录为金钱蒲Acorus gramineus Soland.)，具有开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃的功效。水菖蒲为天南星科菖蒲属植物水菖蒲(Acorus calamus Linnaeus)的干燥根茎，具有温胃，消炎止痛的功效。古人以“菖蒲”记为石菖蒲，在《神农本草经》中为被列为草类上品，并以“一寸九节者良”作为优品，称“九节菖蒲”。但现代研究把毛茛科植物阿尔泰银莲花Anemone altaica Fischer ex C.A.Meyer的干燥根茎作为九节菖蒲，具有开窍祛痰，安神醒脾的功效。现有研究表明，石菖蒲与水菖蒲的药材来源、化学成分、药理作用均不相同，不能相互替代。目前，在药品监督中发现药材经营和使用部门存在将水菖蒲误用为石菖蒲、石菖蒲替代为九节菖蒲的现象，同时，菖蒲类药材存在同名异物而导致的掺假，严重影响了临床药效发挥。因此，寻找一种简单、高效且可靠的分别鉴定石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的方法显得尤为重要。
[0003]多重连接探针扩增技术(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,MLPA)是由一种针对目的DNA序列进行定性和半定量分析的新技术，具有特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、高通量和多重检测等优势。其原理是样品DNA序列在高温下变性成为单链，探针与目标片段杂交结合，在连接酶的作用下将左右探针连接成完整片段，所有连接片段经通用引物扩增，利用毛细管电泳实现对检测产物的特异性和高灵敏度分析。具有特异性好，灵敏性高，操作简便，无需测序的优点。目前，该技术已应用于HPV等临床诊断，食物过敏原和转基因成分检测，川贝母、金钱白花蛇等中药材真伪鉴定等多个领域。目前还没有采用MLPA方法对三种菖蒲类药材进行鉴别的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种快速鉴别石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的方法，该方法针对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的核基因序列设计特异性探针，采用MLPA技术并结合熔解曲线，不仅提高了三种菖蒲类药材的检测效率，同时还具有很高的检测灵敏度和特异性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术使用了以下技术手段：
[0006]一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法，它包括以下步骤：
[0007]1)提取样品基因组DNA；
[0008]2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增石菖蒲、水菖蒲、九节
菖蒲核基因片段；
[0009]3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；
[0010]4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；
[0011]5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；
[0012]6)收集熔解曲线信号，观测Tm值，
[0013]其中，所述MLPA探针共3组，每一组分别由左探针和右探针组成，其中：
[0014]第一组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGGGTCCGGTCGCGGCACGGCATGCGGTGGG(SEQ ID NO:1)；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC(SEQ ID NO:2)；
[0015]第二组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTGATCGCGGCACGGCATGCGGTGGC(SEQ ID NO:3)；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC(SEQ ID NO:2)；
[0016]第三组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTCAGAATTGTATACTCATCCCCCAAAGACGAAA(SEQ ID NO:4)；右探针：TGACGCGCACGCCTCGCCGCTCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC(SEQ ID NO:5)。
[0017]其中，所述石菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述水菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、所述九节菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0018]进一步地，用于扩增所述石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲核基因片段的特异性引物的上、下游引物序列如下；
[0019]上游引物:CGAGGGCACGCCTGCCT(SEQ ID NO:9)
[0020]下游引物:GACGCTTCTCCAGACTACAAT(SEQ ID NO:10)
[0021]其中，所述通用引物的上、下游引物序列如下：
[0022]上游引物:GGGTTCCCTAAGGGTTGGA(SEQ ID NO:11)
[0023]下游引物:TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC(SEQ ID NO:12)
[0024]所述DNA连接酶为9
°
N DNA Ligase，用于连接左右探针。
[0025]其中，步骤3)中所述杂交的温度是70℃，时间20min。
[0026]其中，步骤5)中所述实时荧光定量PCR扩增的反应循环数是36循环。
[0027]步骤6)中，通过观测样品熔解曲线峰和Tm值判断结果，若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为84.32℃
±
0.07℃，则为石菖蒲；若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为86.03℃
±
0.06℃，则为水菖蒲；若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为82.53℃
±
0.05℃，则为九节菖蒲；若样品出现两个或三个相应Tm值的熔解曲线峰，则为两种或三种菖蒲的混合样品。
[0028]本专利技术的有益效果是：本专利技术能用于鉴别石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲及其掺混药材，有利于规范药材使用，提高临床用药的有效性和安全性，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。该方法特异性强，灵敏度高，能检测出极少量的药材DNA。
[0029]与传统MLPA相比，本专利技术还缩短了探针与靶序列杂交的时间，应用了连接效率更高的连接酶，实现了缩短样品检测周期的目的。同时，将MLPA方法与熔解曲线相结合，通过观测熔解曲线和Tm值对样品的鉴别，进一步提高了检测效率。
附图说明
[0030]图1是方法检测特异性实验结果。
[0031]图2是方法检测灵敏度实验结果(石菖蒲)。
[0032]图3是方法检测灵敏度实验结果(水菖蒲)。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以提取的基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的核基因片段；3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值，其中，所述MLPA探针共3组，每一组分别由左探针和右探针组成，其中：第一组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGGGTCCGGTCGCGGCACGGCATGCGGTGGG；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC；第二组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTGATCGCGGCACGGCATGCGGTGGC；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC；第三组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTCAGAATTGTATACTCATCCCCCAAAGACGAAA；右探针：TGACGCGCACGCCTCGCCGCTCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述石菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述水菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，胡敏，王文斌，徐玲，程华春，李小芳，莫静，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：