一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的制造技术

本发明专利技术公开一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的SNP引物及其应用


[0001]本专利技术属于中药材分子鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定中药材绞股蓝和乌蔹莓的
SNP
（单核苷酸多态性，
single nucleotide polymorphism
）引物
。

技术介绍

[0002]绞股蓝
Gynostemma pentaphyllum
（
Thunb.
）
Makino
为葫芦科绞股蓝属绞股蓝的干燥全草，又称“七叶胆”、“五叶参”、“遍地生根”，具有清热解毒
、
止咳清肺祛痰
、
养心安神
、
补气生精之功效，是目前除人参属外含有人参皂苷的唯一植物，被誉为“第二人参”和“南方人参”。
由于绞股蓝具有多种药效及保健功效，已经开发成一系列药用或药食两用的产品，具有非常广阔的开发前景
。
[0003]目前，药材市场上绞股蓝主要混淆品为乌蔹莓，乌蔹莓来源于葡萄科乌蔹莓属乌蔹莓
Cayratia japonica (Thunb) Gagn.
的全草，由于绞股蓝和乌蔹莓的生长环境相似，而且全草有具有相似的形态特征，鲜品都较难分辨，而干品由于比较松脆，容易被压碎，更加难于辨别，因此，民间常有把乌蔹莓误认为绞股蓝，甚至有书籍上也把乌蔹莓与绞股蓝相互混淆
。
[0004]目前主要通过显微鉴别
、
化学成分仪器检测等方法对绞股蓝与乌蔹莓进行鉴定，而这些方法较为繁琐
。
王翀等采用
ISSR
‑
PCR
技术在
DNA
分子水平上鉴别７种绞股蓝属植物，可有效区分鉴别常见绞股蓝属植物（
ISSR
‑
PCR
鉴别绞股蓝属７种植物
[J] . 中草药，
2008
，
39(
４
) ：
588
‑
591
．）
。
蒋军富等采用
RAPD
技术对绞股蓝及其伪品进行
DNA
指纹图谱鉴别研究，得到不同产地绞股蓝及乌蔹莓基因组的差异性
DNA
片段， 这些片段可以区别两者，为绞股蓝的品种鉴定
、
辅助选择育种等研究奠定了基础
(
绞股蓝的
RAPD
指纹图谱鉴定及其特异
DNA
片段克隆
、
序列分析
[J]．中药材，
2009
，
32(2)
：
190
‑
193
．
)。
刘镛等研究表明绞股蓝与其混伪品的
ITS
２序列的二级结构在４个螺旋区的茎环数目
、
大小
、
位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异，用最大简约法构建的系统发育树分枝明显，可有效区分绞股蓝与其混伪品
。
[0005]此外，一些专利文献也报导了针对绞股蓝与乌蔹莓的鉴别方法
。
例如
CN102191333A
公开了一种在
DNA
水平鉴定绞股蓝与乌蔹莓的方法，该方法利用绞股蓝
DNA
特征性片段
SCAR
标记克隆测序的结果，设计绞股蓝
SCAR
标记的特异引物，从而对绞股蓝进行
DNA
水平鉴定
。
[0006]与
SSR、SCAR、RAPD
等分子标记相比，
SNP
的数量更加丰富，更适合用于复杂性状的遗传分析，
SNP
技术不需要对扩增产物进行测序，操作较为简单，样品也不易受到污染，具有较高的特异性和准确性
。
[0007]CN 114990246A
公开了一种用于鉴定乌蔹莓及其伪品的
SNP
引物，
SNP
位点在叶绿体基因组
psbA
‑
trnH
序列，利用该引物对样品进行扩增，乌蔹莓能够扩增出一条
491bp
的条带，而包括绞股蓝在内的其它样品都没有扩增产物
。
该
SNP
引物虽然也能用于乌蔹莓与绞股蓝的鉴别，然而由于其不能扩增绞股蓝，因此无法实现绞股蓝与除乌蔹莓以外的其它伪品的鉴别区分，无法从掺伪混合样品中特异性鉴别出绞股蓝，另外，在利用该引物对绞股蓝与
乌敛莓的掺伪混合样品进行检测时，还存在灵敏度低等缺陷
。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供另一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的
SNP
引物，通过在核糖体 ITS2
序列中筛选
SNP 位点并设计引物，优化反应体系和扩增条件，最终实现了绞股蓝与乌敛莓以及其它伪品的鉴别区分
。
一方面，本专利技术为绞股蓝与乌蔹莓的鉴别区分提供更多的
SNP
位点和引物选择；另一方面，本专利技术能更好地检测绞股蓝掺伪混合样品，能将混淆品中极低量的绞股蓝检测出来
。
为实现上述目的，本专利技术使用了以下技术方案：一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的
SNP
引物，所述
SNP
引物的正向引物序列如
SEQ ID NO:1
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:2
所示
。
[0009]其中，正向引物的倒数第二位
C
为错配碱基，目的在于增强引物的特异性
。
[0010]本专利技术进一步提供了所述的
SNP
引物在鉴定绞股蓝和乌蔹莓中的应用，以及一种鉴定绞股蓝和乌蔹莓的试剂盒
。
[0011]本专利技术还提供了一种高效快速鉴定绞股蓝和乌蔹莓的方法，该方法包括以下步骤：1）提取待测样品的基因组
DNA
；2）以提取的基因组
DNA
为模板，利用所述的
SNP
引物进行
PCR
扩增；3）对扩增产物进行凝胶电泳检测
。
[0012]其中，所述
PCR
扩增的反应体系中含有
0.4
‑
0.8
μ
L
的正向引物和反向引物
。
[0013]进一步地，所述
PCR
扩增的反应体系中还含有1μ
L
模板
DNA、12.5
μ
L
预混液，总体积
25
μ
L。
[0014]其中，所述
PCR
扩增的反应程序为：
95℃
预变性，保持
3min
；
95℃
变性，保持
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的
SNP
引物，其特征在于，所述
SNP
引物的正向引物序列如
SEQ ID NO:1
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:2
所示
。2.
权利要求 1
所述的
SNP
引物在鉴定绞股蓝和乌蔹莓中的应用
。3.
一种鉴定绞股蓝和乌蔹莓的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的
SNP
引物
。4.
一种鉴定绞股蓝和乌蔹莓的方法，其特征在于包括以下步骤：1）提取待测样品的基因组
DNA
；2）以提取的基因组
DNA
为模板，利用权利要求1所述的
SNP
引物进行
PCR
扩增；3）对扩增产物进行凝胶电泳检测
。5.
如权利要求4所述鉴定绞股蓝和乌蔹莓的方法，其特征在于：所述
PCR
扩增的反应体系中含有
0.4
‑
0.8
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，胡敏，赵雄峰，葛锦蓉，陈小艳，覃桂，刘睿康，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：