一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法，包括以下步骤：提取样品基因组DNA；利用植物ITS2序列通用扩增引物对苍术、关苍术的ITS2序列进行扩增；将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；利用DNA连接酶将杂交产物进行连接；利用通用引物对连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；收集熔解曲线信号，观测Tm值。本发明专利技术能够在很短的时间内鉴别中药材苍术及其常见混伪品关苍术，该方法具有特异性强、灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。领域有很好的应用前景。领域有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法


[0001]本专利技术属于中药材鉴定领域，具体涉及一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法。

技术介绍

[0002]2020版《中国药典》收载的苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，其富含炔类、多糖以及倍半萜等多种药效成分，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效，现代药理学研究表明其在抗癌、抗炎、抗菌和保护胃肠道等方面也具有明显的药理作用。近年来，过度开采和生长环境的破环造成苍术野生资源匮乏，不法商家为牟取利益而将类似药材假冒苍术出售，造成苍术市场秩序混乱，严重威胁了苍术的临床用药安全和市场监管。关苍术为苍术的同属植物，虽未被《中国药典》收载，但在北方地区常把关苍术的干燥根茎作为北苍术药用。有研究发现，关苍术的药用成分与白术更相似，甚至在日本药典中是作为药材白术的基源物种之一。将关苍术误用为苍术不仅达不到预期的治疗目的，甚至可能造成患者病症加重。由于关苍术的外观性状、化学成分与苍术具有较高的相似性，通过颜色、气味、显微结构和薄层色谱等传统中药材鉴别方法难以准确鉴别两者。因此，开发快速、准确的鉴别苍术与关苍术的方法对苍术的临床安全用药和市场监管具有重要意义。
[0003]多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,MLPA)，是一种高通量新兴分子诊断技术，可以在较短时间内检测核酸序列的差异。MLPA利用DNA变性、杂交、连接并结合PCR反应，在使用少量的DNA的情况下实现在一个反应中检测多达50个基因组DNA序列的差异。作为一种简单、经济的基因检测方法。MLPA最初是应用于人类疾病的检测，但其应用已扩展到病毒、过敏原、转基因物种检测等方面。此外，MLPA技术在动、植物药材鉴定也发挥了重要作用，将MLPA与熔解曲线结合可根据探针熔解温度的差异对中药材基源进行鉴定，目前已成功应用于名贵中药材川贝母、龟甲等。与其他分子生物学技术如DNA条形码、PCR
‑
RFLP、SSR等相比，MLPA法更加简捷、成本更低廉、更适用于常规中药材的鉴别。
[0004]基于此，有必要开发一种基于多重连接探针扩增技术对中药材苍术及其常见混伪品关苍术进行鉴定的方法。本专利技术根据苍术与关苍术核基因组片段序列差异设计了特异性MLPA探针，由熔解曲线分析得到探针的熔解曲线峰和熔解温度，根据出峰情况和Tm值的差异来鉴别苍术与关苍术，并进行了特异性、灵敏度考察。本专利技术提供的鉴定方法快速、准确，为苍术及其制品的用药安全和市场监管提供科学依据和保障，也为其他中药材的基源研究提供了参考。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种快速简捷、稳定可靠、成本低廉的鉴定中药材苍术及其常见混伪品关苍术的鉴定方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术首先开发出一种可快速鉴别苍术、关苍术的MLPA探针，该探针由苍术左探针、关苍术左探针和一个共同右探针组成，各探针的碱基序列如下：
[0007]苍术左探针C
‑
LPO：5
’‑
GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCGCGCTTGGTCTCCAGTTCCCATGGTACGGC
‑3’
(SEQ ID NO:1)
[0008]关苍术左探针G
‑
LPO：5
’‑
GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTTAATATTTGGTCTCCTGTGCCCACGTTACGGT
‑3’
(SEQ ID NO:2)
[0009]共同右探针RPO：5
’‑
TGGCCTAAAAGTGAGTCGCCTTCGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC
‑3’
(SEQ ID NO:3)；
[0010]在此基础上，本专利技术开发出一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法，该方法包括以下步骤：
[0011]1)提取样品基因组DNA；
[0012]2)以步骤1)的基因组DNA为模板，利用中国药典推荐的植物ITS2序列通用扩增引物ITS2F/3R对苍术、关苍术的ITS2序列进行扩增；
[0013]3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；
[0014]4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；
[0015]5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；
[0016]6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。
[0017]所述关苍术左探针：苍术左探针的摩尔量比为1
‑
5：1。优选地摩尔量比为3：1。
[0018]优选地，所述杂交温度为68℃，时间20min。
[0019]优选地，所述DNA连接酶为9
°
N DNA Ligase，用于连接左、右探针。
[0020]优选地，所述连接温度为45℃，时间15min。
[0021]优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2
×
T5 Fast qPCR Mix 10μL，10μM上游通用引物0.8μL，10μM下游通用引物0.8μL，50
×
ROX Reference Dye I 0.4μL，连接产物5μL，ddH2O 3μL；
[0022]优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为95℃1min；95℃10s，60℃5s，72℃15s，36个循环；72℃5min。
[0023]步骤6)中，通过观测样品熔解曲线峰和Tm值判断结果，若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为84.2℃
±
0.1℃，则为苍术；若样品出现双熔解曲线峰并且熔解峰Tm值分别为82.1℃
±
0.1℃和84.2℃
±
0.1℃，则为关苍术。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术能够在很短的时间内鉴别中药材苍术及其常见混伪品关苍术，该方法具有特异性强、灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。
[0026]本专利技术还能实现苍术药材中掺混关苍术的鉴定，有利于保障市场流通的苍术药材质量，提高用药安全性。
附图说明
[0027]图1是特异性探针筛选实验。A是3条关苍术单一探针与苍术、关苍术核基因组序列片段纯化产物反应的熔解曲线实验图谱。B是苍术探针与苍术、关苍术核基因组序列片段纯化产物反应的熔解曲线实验图谱。
[0028]图2是不同杂交温度下关苍术特异性探针与苍术、关苍术DNA反应的扩增曲线图谱。
[0029]图3是不同杂交温度下关苍术特异性探针与苍术、关苍术DNA反应的熔解曲线图谱。
[0030]图4是不同比例混合探针筛选实验。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重连接探针扩增技术鉴别苍术与关苍术的方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以步骤1)的基因组DNA为模板，利用中国药典推荐的植物ITS2序列通用扩增引物ITS2F/3R对苍术、关苍术的ITS2序列进行扩增；3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值，其中，所述MLPA探针由苍术左探针、关苍术左探针和一个共同右探针组成，各探针的序列如下：苍术左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCGCGCTTGGTCTCCAGTTCCCATGGTACGGC；关苍术左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTTAATATTTGGTCTCCTGTGCCCACGTTACGGT；共同右探针：TGGCCTAAAAGTGAGTCGCCTTCGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。2.如权利要求1所述的鉴别苍术与关苍术的方法，其特征在于：所述关苍术左探针：苍术左探针的摩尔量比为1
‑
5：1。3.如权利要求1所述的鉴别苍术与关苍术的方法，其特征在于：所述关苍术左探针：苍术左探针的摩尔量比为3：1。4.如权利要求1所述的鉴别苍术与关苍术的方法，其特征在于：所述杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，聂晶，胡敏，莫静，徐玲，程华春，费毅琴，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：