用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记制造技术

本发明专利技术属于分子育种技术领域，具体涉及用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记。本发明专利技术提供用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记，其包括标记AC1～AC16中的一个或更多个或全部；所述AC1～AC16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示。本发明专利技术的SCAR标记特异性强、稳定性好，可准确鉴定待测甘蓝细胞质雄性不育系中是否含有相应的异源萝卜线粒体片段及其相对含量，有利于甘蓝细胞质雄性不育系的早期选育，提高育种效率，降低育种成本。降低育种成本。

【技术实现步骤摘要】
al.2015；Du et al.2016；Kang et al.2017；Arimura et al.2018)。因此我们推测，Ogura CMSR3虽然经过数次改良，但其细胞质中仍保留了许多萝卜细胞质成分，诸多不良性状可能是由于异源细胞质片段与核基因不协调导致的。
[0006]我们采用二代Illumina Hiseq结合三代ONT测序技术，对甘蓝Ogura CMSR3品种CMSR302
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12及其保持系02
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12的叶绿体和线粒体基因组进行测序和比对分析。我们发现CMSR302
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12线粒体基因组中含有35,618bp的萝卜线粒体基因组片段，占线粒体DNA(mtDNA)的13.84％。虽然通过高通量测序技术能够准确地检测甘蓝Ogura CMS材料中的异源线粒体片段，但存在周期长、花费高等缺点。因此，有必要针对甘蓝Ogura CMS开发异源线粒体片段的特异性标记，用于快速准确鉴定甘蓝Ogura CMS材料中萝卜线粒体基因组片段的相对含量，以便更好地挖掘异源胞质含量更少的甘蓝细胞质雄性不育源。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是如何快速、准确并且经济地鉴定甘蓝Ogura细胞质雄性不育系(简称CMS)中异源萝卜线粒体片段的存在、缺失和/或序列。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记，其特征在于，包括标记AC1～AC16中的一个或更多个或全部；所述AC1～AC16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示。
[0009]本专利技术还提供用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的引物组，其特征在于，包括引物对AC1p～AC16p中的一对或更多对或全部；
[0010]所述AC1p～AC16p分别用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示的异源萝卜线粒体片段；
[0011]所述AC1p～AC16p的序列信息如下：
[0012][0013][0014]本专利技术还提供用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述引物组。
[0015]优选地，所述引物组中的每一种引物均独立包装，为液态或粉末状。
[0016]优选地，所述试剂盒还包含用于进行PCR和/或凝胶电泳的通用试剂。
[0017]所述通用试剂可以是DNA聚合酶、PCR缓冲液、TBE缓冲液、核酸染料等。
[0018]上述SCAR标记或上述引物组或任一上述试剂盒在检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0019]本专利技术还提供一种检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的方法，其特征在于，包括：
[0020]a)提取待测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系样品的基因组DNA；
[0021]b)以所述基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR；
[0022]c)检测PCR产物以确定所述样品的基因组DNA中是否包含相应的异源萝卜线粒体片段或者所包含的异源萝卜线粒体片段的序列。
[0023]优选地，通过凝胶电泳或测序的方法来检测PCR产物。
[0024]所述凝胶电泳可以是琼脂糖凝胶电泳。
[0025]PCR产物经凝胶电泳后，若出现引物对扩增的相应大小的特征条带，则所述样品的基因组DNA中包含相应的异源萝卜线粒体片段；若没有出现引物对扩增的相应大小的特征条带，则所述样品的基因组DNA中不含相应的异源萝卜线粒体片段。进一步地，所述样品的基因组DNA中包含的异源萝卜线粒体片段的序列可以通过测序确定。
[0026]优选地，PCR体系包含：10μmol/L正反向引物各1μL，2
×
PCR Mix 10μL，ddH2O 7μL，基因组DNA 1μL；PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15～60s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0027]优选地，在待测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系的苗期进行异源萝卜线粒体片段的检测。
[0028]本专利技术成功开发出用于快速准确鉴定甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记AC1～AC16，以及用于扩增AC1～AC16的引物对AC1p～AC16p。经实验证明，AC1p～AC16p在已知含有35,618bp萝卜线粒体基因组片段的甘蓝Ogura CMS品种“CMSR302
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12”和萝卜品种“RFRs”中均扩增出相应的目的片段，而在不含萝卜线粒体基因组片段的自交系甘蓝品种“02
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12”中无扩增产物。利用AC1p～AC16p检测96份甘蓝自交系材料，均无扩增产物。利用AC1p～AC16p检测8株甘蓝Ogura细胞质雄性不育系，从7株中扩增出
全部16个SCAR标记，从1株中扩增出7个SCAR标记。因此，本专利技术的标记和引物具有特异性强、稳定性好的优点。
[0029]采用引物对AC1p～AC16p进行甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的辅助鉴定，操作简便易行，在幼苗期就能够快速鉴定出目标株系中含有的萝卜线粒体基因组片段，从而有针对性地选苗定植和配制杂交组合。本专利技术的方法不需要等待漫长的植株生长阶段，不受环境条件和人为因素的影响，大大缩短了甘蓝细胞质雄性不育系的选育周期，提高了育种效率，降低了育种成本。
附图说明
[0030]图1为引物对AC1p～AC16p在已知含有35,618bp异源萝卜线粒体片段的甘蓝Ogura CMS品种“CMSR302
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12”中的扩增情况。泳道M为2000bp的DNA Marker；泳道1～16依次为引物对AC1p～AC16p的扩增产物，其大小分别为737bp、564bp、790bp、898bp、587bp、729bp、988bp、789bp、774bp、779bp、788bp、669bp、897bp、902bp、1019bp、967bp。
[0031]图2为引物对AC1p～AC16p在已知含有35,618bp异源萝卜线粒体片段的萝卜品种“RFRs”中的扩增情况。泳道M为2000bp的DNA Marker；泳道1～16依次为引物对AClp～AC16p的扩增产物，其大小分别为737bp、564bp、790bp、898bp、587bp、729bp、988bp、789bp、774bp、779bp、788bp、669bp、897bp、902bp、1019bp、967bp。
[0032]图3为引物对AC1p～AC16p在甘蓝Ogura细胞质雄性不育系“J34”中的扩增情况。泳道M为5000bp的DNA Marker；泳道1～16依次为引物对AC1p～AC16p的扩增结果。
[0033]图4为引物对AC1p～AC16p在甘蓝Ogura细胞质雄性不育系“J35”中的扩增情本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记，其特征在于，包括标记AC1～AC16中的一个或更多个或全部；所述AC1～AC16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示。2.用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的引物组，其特征在于，包括引物对AC1p～AC16p中的一对或更多对或全部；所述AC1p～AC16p分别用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示的异源萝卜线粒体片段；所述AC1p～AC16p的序列信息如下：引物对正向引物的序列(5
’‑3’
)反向引物的序列(5
’‑3’
)AC1pGCAGGAATGCTGCACACTCTGGGACGTTCAGATTGCATACCATAC2pCATGAATTAGAATAAAGTAAGGGAGCGCTTTTAGCAGTCTTCCGAAATAC3pGCAGATTGAAGCATGATTGGGCAGAACTCCTAAGATTCCTTCAC4pTCAGACAGTCTTTTATGCCCTCTAAGATCATACTTGGTCGGGAAAC5pTAGTCTATGTGCCAGTTCAAATCTTAGAACCCATAGGCACCGGACTAC6pTGTGACAAAAGTGATTGGGATGCTTACTAGCCCACGGAACTCATAC7pAGTCCTGACCTTCGTTACTAGAGCCCTTGACTTTCGTGTGTGCGTAAC8pGCATCTCCCACTCGCTTACTGCATCCACTAAACTTCTCAACGGAC9pTTGAGTTTCAGTGGCATAGGACGGATTAGAATCAGTTCGGCGTAC10pGCGTCTGAATACCACTGTCCTCCAGAACATCCACCTACTTACGGAC11pTGAAAAAATCCACCCCCTAACAAGATAAAACAGAGACGGAACCAC12pGAGTCCATACAGGGCTACACGACCCGAGAGTTATTTTGGCTGAC13p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬勇，陈立，方智远，杨丽梅，庄木，吕红豪，王勇，季家磊，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：