利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法技术

本发明专利技术公开了一种利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法。本发明专利技术以水稻GW3p6基因第七内含子和第八外显子边界区一段15碱基序列5

【技术实现步骤摘要】
利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法。

技术介绍

[0002]粒型是决定水稻产量及品质的关键性状之一，具有重要的应用价值。GW3p6/OsLG3b/qLGY3基因为一个控制水稻粒型和产量的重要基因。该基因为一个编码含MADS结构域的转录因子OsMADS1，是G蛋白βγ二聚体下游的关键效应子。其最后一个外显子边界区一段15碱基序列5
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tccttcaccaagga
‑3’
突变为13个碱基的序列5
’‑
agtatatatacat
‑3’
，导致剪接位点发生改变。突变基因型会导致水稻粒型细长，提高稻谷的品质和产量。近等基因系粒长和千粒重提高6～7％，单株产量提高8％，除此之外其它农艺性状无变化。将GW3p6基因聚合了另一个控制穗数的杂种优势基因RN3q23后的fuhui676谷物产量增加15％，这两个基因可以解释40％的杂种优势。韩斌院士课题组鉴定了1328份杂交水稻，其中仅约11.5％的两系杂交稻、1.6％的三系杂交稻中含有长粒型基因(Wangetal,Nature Communication,2019,10:2982)。进化分析表明长粒突变源自热带粳稻，通过天然杂交和人工选择扩散到籼稻和温带粳稻中。目前仅少量的现代籼稻和温带粳稻品种含有长粒基因型(Yu etal,PlantBiotechnologyJournal,2018,16:1667
–
1678)。因此qLGY3/OsLG3b/GW3p6的长粒基因型在水稻遗传育种中有很大的应用潜力。
[0003]为促进GW3p6基因在水稻遗传改良中的应用，扬州大学张林等开发了针对该位点Caps标记(申请号201911112386.4)，但这种检测方式需要在PCR后再利用限制性酶切后电泳，价格较为昂贵，操作繁琐，难以高效地对大样本进行大规模的基因型分析。因此需要建立一种简易、廉价、快速准确的基因分型体系。高分辨熔解曲线(High
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resolution melting,HRM)是一种新兴的突变检测及基因分型技术。DNA序列的长度，GC碱基含量及碱基的分布方式等都会影响到双链DNA的解链或熔解过程。HRM检测是基于DNA分子的物理特性进行分析，无需设计特异探针或接头，仅仅在常规PCR反应体系中加入饱和染料即可。操作过程简单，成本低廉并且可以闭管操作，是进行基因型分析的有力手段。但HRM对检测仪器的温度及均一性控制要求较高，如目前已停产的专用于HRM检测的LightScanner，以及部分高端集成了qPCR和HRM检测功能的Lightcycler480，Rotor
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GeneQ和QuantStudioQ6等。但大部分实验室的常规定量PCR仪仅具有普通熔解曲线及TM值检测功能，不能用于HRM基因分型，限制了HRM技术的应用。因此针对GW3p6基因开发基于熔解温度的分子标记具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法，所述功能标记是针对水稻粒型及产量基因GW3p6最后一个外显子边界区一段15碱基序列5
’‑
tccttcaccaagga
‑3’
突变为5
’‑
agtatatatacat
‑3’
的多态位点而开发的。
[0005]本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：一种利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记，所述功能标记由如下两条引物构成：GW3p6
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F：5
’‑
TGATGGTGAGCATGAGGGTG
‑3’
，GW3p6
‑
R：5
’‑
ATACTCCATCATTTTCATAGC
‑3’
。
[0006]上述一种功能标记在鉴定水稻GW3p6基因型中的应用。
[0007]上述一种功能标记在水稻粒型遗传改良中的应用。
[0008]一种利用熔解曲线鉴定水稻GW3p6基因型的方法，其是用如下两条引物对水稻GW3p6基因型进行检测，所述两条引物为：GW3p6
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F：5
’‑
TGATGGTGAGCATGAGGGTG
‑3’
，GW3p6
‑
R：5
’‑
ATACTCCATCATTTTCATAGC
‑3’
。
[0009]进一步的，上述一种利用熔解曲线鉴定水稻GW3p6基因型的方法具体步骤如下：1)提取待测水稻样品DNA；2)利用引物GW3p6
‑
F和GW3p6
‑
R，以步骤1)提取的待测水稻样品DNA为模板，进行PCR扩增反应获得扩增产物：3)以步骤2)获得的扩增产物进行熔解曲线分析，从而鉴定待测水稻样品GW3p6基因型。
[0010]进一步的，上述PCR的扩增体系为：10
×
PCRBuffer1μL，2.5mMeachdNTP0.8μL，10μM的GW3p6
‑
F和GW3p6
‑
R各0.1μL，5U/μLTaKaRataq0.1μL，20
×
Evagreen0.2μL，20～50ng/μL温度内标DNA1μL，20～100ng/μL待测待测水稻样品DNA1μL，加dH2O补液至10μL。
[0011]进一步的，上述PCR的扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸5min。
[0012]进一步的，上述熔解曲线分析中，当熔解曲线为单峰且熔解温度范围为73.82～74.57℃，则待测水稻样品判断为GW3p6基因野生型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重较小；当熔解曲线为单峰且熔解温度范围为70.99～71.42℃，则待测水稻样品判断为GW3p6基因突变型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重较大；当熔解曲线有双峰，且熔解温度范围分别为73.82～74.57℃和70.99～71.42℃，则待测水稻样品判断为GW3p6基因杂合型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重处于野生型和突变型之间。
[0013]进一步的，上述温度内标DNA的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]进一步的，上述温度内标DNA是以质粒pCAMBIA1300为模板，利用正向引物90F和反向引物90R进行扩增得到；所述正向引物90F和反向引物90R为：90F：5
’‑
GAGTTGGTCAAGACCAATGC
‑3’
，90R：5
’‑
AGGCTCTCGATGAGCTGATG
‑3’
。
[0015]本专利技术相对于已有技术的优点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记，其特征在于：所述功能标记由如下两条引物构成：GW3p6
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F：5
’‑
TGATGGTGAGCATGAGGGTG
‑3’
，GW3p6
‑
R：5
’‑
ATACTCCATCATTTTCATAGC
‑3’
。2.如权利要求1所述的功能标记在鉴定水稻GW3p6基因型中的应用。3.如权利要求1所述的功能标记在水稻粒型遗传改良中的应用。4.一种利用熔解曲线鉴定水稻GW3p6基因型的方法，其特征在于：用如下两条引物对水稻GW3p6基因型进行检测，所述两条引物为：GW3p6
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F：5
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TGATGGTGAGCATGAGGGTG
‑3’
，GW3p6
‑
R：5
’‑
ATACTCCATCATTTTCATAGC
‑3’
。5.根据权利要求4所述的利用熔解曲线鉴定水稻GW3p6基因型的方法，其特征在于：具体步骤如下：1）提取待测水稻样品DNA；2）利用引物GW3p6
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F和GW3p6
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R，以步骤1）提取的待测水稻样品DNA为模板，进行PCR扩增反应获得扩增产物：3）以步骤2）获得的扩增产物进行熔解曲线分析，从而鉴定待测水稻样品GW3p6基因型。6.根据权利要求5所述的利用熔解曲线鉴定水稻GW3p6基因型的方法，其特征在于：所述PCR的扩增体系为：10
×
PCR Buffer 1μL，2.5mM each dNTP 0.8μL，10μM的GW3p6
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F和GW3p6
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨绍华，郭新睿，陈在杰，刘华清，桂毅杰，陈睿，周淑芬，王锋，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：