一种RALGDS-KRT8-AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种RALGDS

【技术实现步骤摘要】
一种RALGDS
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KRT8
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AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种RALGDS
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KRT8
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AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70％～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。
[0003]自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。在癌症发生早期，肿瘤相关抗原的暴露即可被人体免疫系统识别，产生肿瘤相关自身抗体，甚至在外周血中也可维持高水平的自身抗体，可被本领域常规技术手段(例如酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA))灵敏地检测到。本领域公认，肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的较好指标，利用肿瘤诱导产生的自身抗体来反应患者肿瘤发生机疾病进展过程，正成为寻找用于肿瘤早期诊断及预后判断新靶标的重要方向。
[0004]但是，由于肿瘤的异质性和不同个体间免疫系统反应的不同，单个肿瘤自身抗体在肿瘤患者中的敏感性不够高(通常为5％～20％)。因此，单一的自身抗体生物标志物不足以提供肺癌发生、进展的信息，联合使用多个不同的肿瘤自身抗体更能增加检测敏感性，但是这样检测具有步骤繁多且花费较高，效率低，特异性不足，时间长等缺点。因此，急需提供一种能够提高肺癌自身抗体的检出率，增加检测敏感性的方法。
[0005]RALGDS、KRT8、AIF1是三个肺癌相关肿瘤自身抗原。RALGDS是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活RalA或RalB的GTP酶活性并在细胞内转运中发挥重要作用，也是KRAS信号通路的重要效应分子。KRAS作为肺癌的一种驱动基因，对肺癌的进程起着至关重要的作用，而RALGDS的水平正是KRAS基因功能的体现。KRT8被发现在包括肺癌的多种癌症中都有高表达现象，并且它的高表达对于肺癌患者来说是个预后不良信号。AIF1分子是一种肺癌预后相关分子，曾被选入GBOCRL
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IIPr分子组合中，用于泛癌种预后情况的评估。单独使用它们作为肺癌自身抗体检测的抗原分子时，都有一定的漏检率。因此有必要制备融合这三种抗原的表位研制融合抗原，来实现高敏感性和特异性的肺癌早期检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种筛查早期肺癌的融合蛋白，通过分别筛选RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白中的具有强抗原决定簇的抗原片段，并化学合成RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段、AIF1抗原片段串联的编码基因，制备融合蛋白，用于自身抗体检测，可以高效预测个体是否肺癌患者，提高肺癌早期筛查的特异性和敏感性，降低了临床漏检现象的发生，具有重要的科学意义和临床应用价值。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段，以及连接这三种抗原片段的连接肽。
[0008]本专利技术综合大量公共数据，比较肺癌患者和正常人群血清中的自身抗体，筛选获得系列能较好地区分肺癌患者正常人群的系列抗原蛋白，并从中进一步筛选到能用于组合制备融合蛋白的RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白。
[0009]所述RALGDS抗原片段为从RALGDS蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段；所述KRT8抗原片段为从KRT8蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段；所述AIF1抗原片段为从AIF1蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段。
[0010]所述RALGDS蛋白具有如序列表Seq ID NO.6所示的氨基酸序列，KRT8蛋白具有如序列表Seq ID NO.7所示的氨基酸序列，AIF1蛋白具有如序列表Seq ID NO.7所示的氨基酸序列。
[0011]本专利技术采用RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段制备的融合蛋白，作为肺癌肿瘤生物标志物进行检测，其肺癌患者的检出率明显高于单一蛋白时的检出率。
[0012]进一步地，所述RALGDS抗原片段具有如序列表Seq ID NO.1所示的氨基酸序列；所述KRT8抗原片段具有如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列；所述AIF1抗原片段具有如序列表Seq ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0013]所述的RALGDS蛋白片段为RALGDS蛋白中第210个氨基酸至第390个氨基酸；所述的KRT8蛋白片段为KRT8蛋白中第252个氨基酸至第483个氨基酸；所述的AIF1蛋白片段为AIF1蛋白中第1个氨基酸至第147个氨基酸。
[0014]进一步地，所述RALGDS抗原片段分布在融合蛋白的N端、AIF1抗原片段分布在融合蛋白的C端、KRT8抗原片段分布在RALGDS抗原片段和AIF1抗原片段之间。
[0015]本专利技术经研究证明，RALGDS、KRT8和AIF1三种抗原片段在不同排列顺序组合的融合蛋白，检测性能也存在区别，优选采用RALGDS抗原片段分布在融合蛋白的N端、AIF1抗原片段分布在融合蛋白的C端、KRT8抗原片段分布在RALGDS抗原片段和AIF1抗原片段之间，这样的排列顺序制备的RALGDS
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KRT8
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AIF1融合蛋白，免疫原性更强，在肺癌检测中具有更好的敏感性。
[0016]进一步地，所述融合蛋白具有如序列表Seq ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0017]进一步地，所述的RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段之间均通连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列为谷氨酸
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丙氨酸
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丙氨酸
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丙氨酸
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赖氨酸(该连接肽能尽量让抗原表位充分暴露)。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白的编码基因，所述基因能够编码如上所述的融合蛋白。
[0019]进一步地，所述基因具有如序列表Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。
[0020]在一些方式中，所述基因序列前后两端分别有Ncol和Ndel两种限制性内切酶。
[0021]再一方面，本专利技术提供了一种用于预测个体是否肺癌患者的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的融合蛋白，或如上所述的编码基因编码的融合蛋白。
[0022]再一方面，本专利技术提供了如上所述的融合蛋白用于制备预测个体是否肺癌患者的试剂的用途。
[0023]再一方面，本专利技术提供了如上所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0024](1)筛选出RALGDS抗原蛋白中含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段，以及连接这三种抗原片段的连接肽。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述RALGDS抗原片段具有如序列表SeqID NO.1所示的氨基酸序列；所述KRT8抗原片段具有如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列；所述AIF1抗原片段具有如序列表Seq ID NO.3所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述RALGDS抗原片段分布在融合蛋白的N端、AIF1抗原片段分布在融合蛋白的C端、KRT8抗原片段分布在RALGDS抗原片段和AIF1抗原片段之间。4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段之间均通连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列为谷氨酸
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丙氨酸
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丙氨酸
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丙氨酸
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赖氨酸。5.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，能够编码如权利要求1～4任一项所述的融合蛋白。6.如权利要求5所述的编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙苏彭，康美华，阴亮，孙立平，
申请(专利权)人：杭州凯保罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：