一种Claudin2-MAGEA3融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种Claudin2

【技术实现步骤摘要】
一种Claudin2
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MAGEA3融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种Claudin2
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MAGEA3融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70％～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。
[0003]自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。在癌症发生早期，肿瘤相关抗原的暴露即可被人体免疫系统识别，产生肿瘤相关自身抗体，甚至在外周血中也可维持高水平的自身抗体，可被本领域常规技术手段(例如酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA))灵敏地检测到。本领域公认，肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的较好指标，利用肿瘤诱导产生的自身抗体来反应患者肿瘤发生机疾病进展过程，正成为寻找用于肿瘤早期诊断及预后判断新靶标的重要方向。
[0004]但是，由于肿瘤的异质性和不同个体间免疫系统反应的不同，单个肿瘤自身抗体在肿瘤患者中的敏感性不够高(通常为5％～20％)。因此，单一的自身抗体生物标志物不足以提供肺癌发生、进展的信息，联合使用多个不同的肿瘤自身抗体更能增加检测敏感性，但是这样检测具有步骤繁多且花费较高，效率低，特异性不足，时间长等缺点。因此，急需提供一种能够提高肺癌自身抗体的检出率，增加检测敏感性的方法。
[0005]Claudin2和MAGEA3是两个肺癌相关肿瘤自身抗原。Claudin2作为紧密连接复合物的主要成分，调节上皮细胞的通透性；而在肺腺癌组织中claudin2加速了癌细胞的增殖和转移，多项抑制claudin2活性或表达的研究表明，降低claudin2的功能可以显著抑制癌细胞生长。MAGEA3又称肿瘤睾丸抗原1.3，它被发现在接近一半的II期非小细胞肺癌组织中有表达，并且展现了作为预后标志物的潜力，同时作为一种肿瘤免疫治疗的靶点正在进行临床中。单独使用它们作为肺癌自身抗体检测的抗原分子时，都有一定的漏检率。因此有必要制备融合两种抗原的表位研制融合抗原，来实现高敏感性和特异性的肺癌早期检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种筛查早期肺癌的融合蛋白，通过分别筛选Claudin2蛋白和MAGEA3蛋白中的具有强抗原决定簇的抗原片段，并化学合成Claudin2抗原片段、MAGEA3抗原片段串联的编码基因，制备融合蛋白，用于自身抗体检测，可以高效预测个体是否肺癌患者，提高肺癌早期筛查的特异性和敏感性，降低了临床漏检现象的发生，具有重要的科学意义和临床应用价值。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括Claudin2抗原片段、
MAGEA3抗原片段，以及连接Claudin2抗原片段和MAGEA3抗原片段的连接肽。
[0008]本专利技术综合大量公共数据，比较肺癌患者和正常人群血清中的自身抗体，筛选获得系列能较好地区分肺癌患者正常人群的系列抗原蛋白，并从中进一步筛选到能用于组合制备融合蛋白的Claudin2抗原蛋白和MAGEA3抗原蛋白。
[0009]所述Claudin2抗原片段为从Claudin2蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段；所述MAGEA3抗原片段为从MAGEA3蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段。
[0010]所述Claudin2蛋白具有如序列表Seq ID NO.5所示的氨基酸序列，MAGEA3蛋白具有如序列表Seq ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0011]本专利技术采用Claudin2抗原片段和MAGEA3抗原片段制备的融合蛋白，作为肺癌肿瘤生物标志物进行检测，其肺癌患者的检出率明显高于单一蛋白时的检出率。
[0012]进一步地，所述Claudin2抗原片段具有如序列表Seq ID NO.1所示的氨基酸序列；所述MAGEA3抗原片段具有如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0013]所述的Claudin2蛋白片段为Claudin2蛋白中第184个氨基酸至第194个氨基酸，所述的MAGEA3蛋白片段为MAGEA3蛋白中第1个氨基酸至第112个氨基酸。
[0014]进一步地，所述的Claudin2抗原片段分布在融合蛋白的N端、MAGEA3抗原片段分布在融合蛋白的C端；所述连接肽的氨基酸序列为甘氨酸
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甘氨酸
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丝氨酸。
[0015]所述的Claudin2蛋白片段分布在融合蛋白的N端(氨基端)、MAGEA3蛋白片段分布在融合蛋白的C端(羧基端)。
[0016]进一步地，所述融合蛋白具有如序列表Seq ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0017]另一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白的编码基因，所述基因能够编码如上所述的融合蛋白。
[0018]进一步地，所述基因具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0019]在一些方式中，所述基因序列前后两端分别有Ncol和Ndel两种限制性内切酶。
[0020]再一方面，本专利技术提供了一种用于预测个体是否肺癌患者的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的融合蛋白，或如上所述的编码基因编码的融合蛋白。
[0021]再一方面，本专利技术提供了如上所述的融合蛋白用于制备预测个体是否肺癌患者的试剂的用途。
[0022]再一方面，本专利技术提供了如上所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0023](1)筛选出Claudin2抗原蛋白中含有强抗原决定簇的Claudin2抗原片段，筛选出MAGEA3抗原蛋白中含有强抗原决定簇的MAGEA3抗原片段；
[0024](2)化学合成Claudin2抗原片段、MAGEA3抗原片段串联的编码基因，所述编码基因具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列；
[0025](3)构建含有编码基因的重组质粒；
[0026](4)重组质粒转化大肠杆菌，挑选阳性表达菌。
[0027]在一些方式中，步骤(1)利用在线分析工具分析，筛选出Claudin2蛋白片段(Claudin2蛋白中含有较强抗原决定簇的第184个氨基酸至第194个氨基酸)、MAGEA3蛋白片段(MAGEA3蛋白中含有较强抗原决定簇的第1个氨基酸至112个氨基酸)。
[0028]进一步地，步骤(3)为：提取PGEM
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5zf，用Ncol和Ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用Ncol和Ndel双酶切化学合成的编码基因，电泳回收双酶切的基因片段；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括Claudin2抗原片段、MAGEA3抗原片段，以及连接Claudin2抗原片段和MAGEA3抗原片段的连接肽。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Claudin2抗原片段具有如序列表SeqID NO.1所示的氨基酸序列；所述MAGEA3抗原片段具有如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Claudin2抗原片段分布在融合蛋白的N端、MAGEA3抗原片段分布在融合蛋白的C端；所述连接肽的氨基酸序列为甘氨酸
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甘氨酸
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丝氨酸。4.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，能够编码如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白。5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。6.一种用于预测个体是否肺癌患者的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，或如权利要求4或5所述的编码基因编码的融合蛋白。7.如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白用于制备预测个体是否肺癌患者的试剂的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙苏彭，康美华，阴亮，孙立平，
申请(专利权)人：杭州凯保罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：