本发明专利技术属于生物医学领域，涉及一种整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列检测方法，其包括：步骤１，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物和针对散在重复序列Ａｌｕ、ＭＩＲ和Ｋｐｎ家族特征序列的特异性引物混合后，通过聚合酶链式反应扩增ＤＮＡ样品；步骤２，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物和ＰＳ引物混合，通过聚合酶链式反应，对由步骤１得到的基因扩增产物再次扩增。本方法能高效、准确地扩增和检测出与人类基因组散在重复序列位置相邻的整合态ＨＰＶ，有助于临床医生对受感染细胞病理演变的转归趋势作出正确判断，从而实现在疾病早期阶段阻断病程发展，防止癌症发生的目标。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种检测整合至人基因组中的人乳头瘤病毒脱氧 核糖核酸成分的实验方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，缩写HPV)是一种闭合环状双股脱氧核糖 核苷酸(DNA)病毒，按其Ll基因的特征可分为100多种亚型。其中，与人类恶性肿瘤有关 的病毒亚型包括5、6、8、11、16、18、31、33型等，它们携带的病毒癌基因，比如E6、E7等，在 长期共存基础上，可随同病毒基因组本身一起整合到受感染人体细胞的基因组中，与染色 体共同复制、转录，最终导致细胞癌变。因此掌握HPV病毒基因组所处的状态，即是处于细 胞内的游离态，还是处于与人类基因组联结的整合态，可以帮助临床医生判断受感染细胞 病理演变的转归趋势，预测它们是将进入一般性的病毒损害和凋亡过程；还是将进入与病 毒长期共存，逐步癌变的过程。据此，医生能够制定合理的治疗方案，在早期阶段及时阻断 病程发展，达到防止癌症发生的目标。散在重复序列(Interspaced repeat sequence，缩写IRS)是基因组上一段短脱氧 核糖核苷酸序列，可用于协助识别染色体上与IRS相邻的某些未知基因的位置。人类很多 IRS已经明确，并得到广泛应用，其中，以Alu、MIR和Kpn序列为最常见。在人类单倍体基 因组中，Alu序列有约100万个拷贝，估计平均每隔3000个碱基，就会出现一段Alu序列。 MIR序列的拷贝数略少于Alu，约为30万个。Kpn序列数量更少些，约3万拷贝。当HPV整 合至染色体后，由于其癌基因E6、E7所在的基因组序列必然位于某个IRS附近，因此可以利 用邻近的IRS，通过聚合酶链式反应技术(Polymerase chainreaction，缩写PCR)检测出整 合态HPV。这种PCR方法只要在某种恰当的针对IRS和HPV基因组的特异性引物存在的情 况下，就可以实施。所得扩增产物可以在琼脂糖电泳或脱氧核糖核苷酸测序中加以鉴定，并 根据电泳条带大小、强弱或脱氧核糖核苷酸测序结果，判断待测样本中，是否存在HPV整合 情况。PCR技术由Muller在1983 1985年间专利技术，其原理是利用引物、脱氧核糖核酸聚 合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸单体在以目标基因为扩增模板的脱氧核糖核酸双链上， 通过变性、退火和延伸的反复循环，将微量原始模板以几何级数方式扩增至IO6 IO9倍以 上，从而能被电泳等方法检测出来。这种检测方法的技术关键在于引物设计。理想的引物 具有专一性识别能力，它们能够从人类数万种基因的复杂背景中，挑选出自己的目标序列， 即脱氧核糖核酸模板，进行特异扩增。通常，在PCR中，所采用的引物为一对含有15 25 个碱基对的寡聚核苷酸单链，它们可分别与目标基因两端分属于正义链和反义链的5’端脱 氧核糖核酸序列互补结合，起到引导脱氧核糖核酸聚合酶进行延伸的作用。理论上，PCR扩 增产物将按2n的指数曲线增长。于是当进行30 40轮反应循环后，原来一条模板就会倍 增至23° 4°条脱氧核糖核酸双链，后者与原始模板序列完全一致，相当于忠实扩增了 IO9 IO12倍左右。但受脱氧核糖核酸聚合酶延伸能力和扩增效率的限制，扩增产物长度一般在31000 2000碱基对之间，增加倍数一般在IO6 IO9倍之间<
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种检测整合至人基因组中的人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸成 分的实验方法，即将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物(即第一组引物)、用于 扩增散在重复序列AhuMIR和Kpn家族成员的引物(即第二组引物)以及一条被命名为 “PS”的引物(即第三组引物)以不同方式混合在一起，进行聚合酶链反应，从而使DNA样 品中与IRS相邻的整合态HPV基因组成分得到高效、准确的扩增和检测。下面三组引物中，用于指代简并引物的符号意义为R = A、G ;Y = C、T ;Κ = G、T ； S = G、C ;M = A、C = A、T ;B = G、C、T ;V = A、G、C ;D = A、G、T ;H = A、C、T ;N = A、G、C、T。 编号020201 (SEQ ID NO 13) 5‘-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTCCTCAGTTTCCTCANY-3’编号020202 (SEQ ID NO 14) 5‘ -GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGATGAGGAAACTGARK-3’第三对编号020301 (SEQ ID NO 15) 5‘-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGTGCACATGTACCCTAVR-3’编号020302 (SEQ ID NO 16) 5‘ -GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGTGCAGGTTTGTTACATA-3’该组第一对引物对针对Alu序列的各家族成员，其识别和结合的目标序列在基因 保守区内，可保证它与多数Alu同源序列有相似的结合能力；第二对引物对是针对MIR各家 族成员的，也是根据基因保守区设计得到；第三对引物对针对的是Kpn序列各家族成员，设 计原理一样。这三对引物均用于半定向扩增IRS与整合态HPV所在部位之间的脱氧核糖核 酸序列。之所以要把这些建立在第二组引物基础上的PCR扩增称为半定向扩增，原因是该 组引物不仅可以扩增含HPV基因的IRS邻近序列，并且对于相邻IRS之间的无关序列，即使 在其不含HPV基因成分的情况下，也有将它们扩增出来的可能性。另外，要注意，该组每个 引物对所包含的两个成员，都是反向互补的，因此在PCR过程中必须将两者分开，绝不可在 同一反应体系中使用同一引物对。第三组PS引物编号030001 (SEQ ID NO 17) :5，-GGTTGATCGTGAGAGT-3，该组引物用于扩增第一、二组引物为基础进行PCR得到的脱氧核糖核酸扩增产 物，引物结合处位于第二组引物内部。这组引物与人或HPV基因组同源性极低，因此得到非 特异性扩增产物的概率也非常低。又因该组引物只扩增前阶段PCR的既得产物，而不扩增 未经过前阶段PCR扩增的人或HPV基因序列，故称其为定向扩增。该组弓I物对整合态HPV的 选择性是通过其在第二组引物内的结合区获得的。如果前次扩增产物不具HPV基因成分， 则其两端将都由第二组引物构成。相同的序列间会反向互补，并以较高退火温度自我结合， 于是阻碍了 PS引物与之的结合。如前次扩增产物含HPV基因成分，则其两端将分属于第一、 二组引物，这两种序列之间并不互补，因此不会自我结合。于是，PS引物便可顺利与目标序 列结合，而不受干扰。然后，它们可与第一组引物一起，对前次含整合态HPV基因的扩增产 物进行第二阶段的扩增，这样便形成了选择性。用于检测整合态HPV的PCR可分为两个阶段1、半定向扩增阶段，和2、全定向扩 增阶段。这两个阶段既可以在同一反应容器中进行，也可以在两个或更多不同的反应容器 中进行。每个阶段都由若干个温度循本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列的方法，其特征在于，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物、用于扩增散在重复序列Ａｌｕ、ＭＩＲ和／或Ｋｐｎ各家族的引物和ＰＳ引物以不同方式加以混合，进行多重和多阶段聚合酶链式反应，使ＤＮＡ样品中整合态ＨＰＶ基因组成分得到扩增和检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何以丰，徐丛剑，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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