一种生物技术领域的色素万寿菊的组织培养方法，包括如下步骤：取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为ＭＳ基本培养基，添加剂为：３ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，３ｍｇ／Ｌ的ＩＡＡ，３０ｇ／Ｌ的蔗糖，６ｇ／Ｌ的植物凝胶；培养条件为：温度２３～２７℃，光照时间１０ｈ～２０ｈ／ｄ，光照强度２０００～３０００ｌｕｘ，不定芽的诱导时间为９～１４ｄ；将分化出的不定芽继代培养，诱导芽生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度２３～２７℃，光照时间１０ｈ～２０ｈ／ｄ，光照强度２０００～３０００ｌｕｘ，培养时间为３０～５０ｄ；将分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为３０ｄ，得到万寿菊再生植株。本发明专利技术的方法取材方便、可高频率地诱导出大量的万寿菊再生芽，再生植株成活率高，再生植株变异小和遗传稳定性较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
的组织培养方法，具体是一种色素万寿菊的组 织培养方法。技术背景万寿菊(Tagetes erecta)又名臭芙蓉，为菊科万寿菊属的一种，原产墨西哥 及美洲地区,现世界各地均有栽培。按用途可将其分为观赏万寿菊和色素万寿菊， 色素万寿菊花瓣内叶黄素含量极其丰富，是提取天然叶黄素的理想原料，叶黄素 可广泛用于食品着色、医药及禽类词料中，具有很高的经济价值。近年来，国外万寿菊品种选育方面取得了长足的进展，而我国Fl代万寿菊育 种尚处于起步阶段， 一些涉及Fl制种技术如播种技术、育苗技术、亲本识别方 法、授粉方法、父本和母本播种比例、种子采收时间及栽培范围等虽己有报道， 但培育出与国外品种有竞争力的自主产权的品种还需时日，而通过常规的繁殖方 法如种子繁殖，则后代易发生变异；插扦繁殖则耗时长，短时期无论法获得大量 种苗。我国被认为是目前世界上最大的万寿菊潜在消费市场，对色素万寿菊种子 的需求量大，除了加强制种技术的研制外，寻找及建立一种色素万寿菊的快速繁 殖方法已成当务之急，采用组织培养法对具有优良品种特性的万寿菊进行快速繁 殖，在短期内生产出大量整齐均匀的健壮种苗，建立一个高效的植株再生体系， 有利于种质资源的保存和优良品种的推广，同时也为基因工程育种奠定了基础。经对现有技术的文献检索发现，邹永梅、黄雪芳在《江苏林业科技》2005年32巻6期17 19页发表了题 为"万寿菊的组织培养和瓶苗开花研究"；苏福才、钱国珍在《内蒙古农牧业学 院学报》1999年20巻3期第108 111页发表了 "万寿菊茎段组织培养"。但 两学者所选取的外植体均为茎段，其取材范围较窄；Marilyn M. Belarmino等在《.Japan. J. Breed》(日本育种杂志)1992 年42期第835 841页发表了 " Callus induction and plant regeneration inAfrican Marigold (Tagetes erecta L.)"(非洲万寿菊愈伤诱导与植物再生)一 文，该学者利用万寿菊胚轴、叶片为外植体诱导植株再生，但利用叶片建立万寿 菊再生体系未能成功；PratibhaMisra等在《In Vitro Cellular & Developmental Biology》 (离 体分子发育生物学)2001年10期466发表了" Direct differentiation of shoot buds in leaf segments of white marigold (Tagetes erecta L).，，(白花万寿 菊叶片直接诱导芽分化)一文，文中提到，利用白花万寿菊叶片为外植体诱导了 植株再生，但可能由于品种基因型的差异，从预备试验结果看，其结果不适宜用于F1色素万寿菊植株再生；Pablo E, Vanegas等在《Plant Cell Tissue and Organ Culture》(植物 细胞组织与器官培养)2002年69期第279 283页发表了" Plant regeneration via organogenesis in marigold"(通过器官发生万寿菊实现植株再生) 一文， 文中提到，利用万寿菊叶片为外植体建立了再生体系，但是存在着不定芽诱导率 低的缺点(69.3%),同时还发现在其条件下诱导植株再生，不定芽还存在着玻璃 化的倾向，不能发育成正常苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种色素万寿菊的组织培养方 法。本专利技术的方法取材方便、可提供的材料充足，可高频率地诱导出大量的万寿 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可达100%，而且具有再生植株变异小和遗 传稳定性较高的优点；本专利技术为扩大万寿菊的繁殖系数、种质保存及其遗传转化 奠定了良好的基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤-步骤一，取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为MS基 本培养基，添加剂为3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L的蔗糖，6g/L的植 物凝胶；培养条件为温度23 27。C，光照时间10h 20h / d，光照强度2000 30001ux，不定芽的诱导时间为9 14d;步骤二，将步骤一诱导得到的不定芽进行继代培养，使用的生长培养基与步 骤一中的分化培养基相同，培养条件为温度23 27°C，光照时间10h 20h/d， 光照强度2000 30001ux，培养时间为30 50d;步骤三，将步骤二得到的分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为30d，得到万寿菊再生植株。步骤一中，所述灭菌具体为取生长45 60d万寿菊植株的幼嫩叶片，用自 来水冲洗lmin，在超净台上用体积分数为75%的酒精浸泡5 8s,用无菌水冲洗 3次，再用质量分数为1.0°/。的次氯酸钠溶液浸泡10s，再经无菌水冲洗5次，将 消毒后的叶片切成0. 5cmX0. 5cm的小块。步骤一中，所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为25001ux， 诱导时间为13d。步骤二中，所述培养条件具体为，光照时间为16h / d，光照强度为25001ux， 诱导时间为40d。本专利技术提供了一种万寿菊组织培养方法，该方法是以叶片作为外植体，通过 器官发生途径得到再生植株。本专利技术的方法取材方便、可提供的材料充足，可高频率地诱导出大量的万寿 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可达100%，而且具有再生植株变异小和遗 传稳定性较高的优点；本专利技术为扩大万寿菊的繁殖系数、种质保存及其遗传转化 奠定了良好的基础。附图说明图1为叶片外植体上诱导产生的不定芽照片图； 图2为不定芽伸长30d后的植株照片图； 图3为万寿菊再生苗照片图。具体实施方式以下实例将结合附图对本专利技术作进一步说明。本实施例在以本专利技术技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例本实施例的万寿菊的组织培养方法，包括以下步骤步骤一，取生长45 60d的万寿菊植株(万寿菊Fl代种子)的幼嫩叶片，用自 来水冲洗lmin，在超净工作台上用体积分数为75%的酒精浸泡5 8、用无菌水 冲洗3次，再用质量分数为1. 0%的次氯酸钠溶液浸泡10s，再经无菌水冲洗5次。 将消毒后的叶片切成0.5cmX0.5cm的小块。之后进行诱导培养，诱导使用的分化培养基具体为MS基本培养基，添加剂为3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L 的蔗糖，6g/L的植物凝胶；培养条件为温度23 27'C，光照时间为16h/d， 光照强度为25001ux，诱导时间为13d，诱导效果见图l。其中，MS基本培养基 的配制可参照Murashige T， Skoog F.在《Physiol. Plant》(植物生理)1962 年15期473-497页发表的《A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures》(一种用于烟草组织培养中快速生长和生物测 定的优化培养基)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种色素万寿菊的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为ＭＳ基本培养基，添加剂为：３ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，３ｍｇ／Ｌ的ＩＡＡ，３０ｇ／Ｌ的蔗糖，６ｇ／Ｌ的植物凝胶；培养条件为 ：温度２３～２７℃，光照时间１０ｈ～２０ｈ／ｄ，光照强度２０００～３０００１ｕｘ，不定芽的诱导时间为９～１４ｄ； 步骤二，将步骤一诱导得到的不定芽进行继代培养，使用的生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度２３～２７℃， 光照时间１０ｈ～２０ｈ／ｄ，光照强度２０００～３０００１ｕｘ，培养时间为３０～５０ｄ； 步骤三，将步骤二得到的分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为３０ｄ，得到万寿菊再生植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾丽，唐克轩，赵子刚，孙佳，杨帆，张永强，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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