本发明专利技术公开了一种酶促水解人参皂苷Ｒｂ↓［１］制备人参皂苷Ｆ↓［２］的方法，其特征在于，人参皂苷Ｒｂ↓［１］分子中的部分糖基被微生物酶选择性切除，生成目标产物人参皂苷Ｆ↓［２］。本发明专利技术所使用的酶来源于镰孢霉菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４９５，可通过发酵制备，是相对易得和便宜的催化剂，用这种方法制备人参皂苷Ｆ↓［２］，具有反应条件温和、专一性强、成本低、回收率高等优点，而且所得人参皂苷Ｆ↓［２］的纯度在９５％以上，可应用于相关制药行业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶促水解制备人参皂苷F2的方法，具体地说，涉及一种用微生物酶特异性水解掉人参皂苷Rln分子中的部分糖基，使其转变为人参皂苷F2的方法。
技术介绍
人参作为世界驰名的中药，其应用历史已相当久远。人参皂苷是人参的主要有 效成分，至今为止，人们已经从人参中分离出至少40多种皂苷单体。根据皂苷元结 构的不同，目前人参皂苷可分为二醇型、三醇型和齐墩果酸型三类，每一类皂苷的 苷元结构相同，仅是连接的糖基侧链不同，但药理活性却有着显著的差别。现代研 究表明皂苷上的糖链对其生物活性有重要影响，去除部分糖基往往能改变其肠道的 吸收率和活性作用。如何将人参中含量较高的皂苷转化为含量较低的皂苷，或将药用价值低的皂苷转化为药用价值高的皂苷， 一直是人参研究的热门课题。人参皂苷F2是人参中含有的一种高活性的二醇型皂苷，但其在人参中的含量很低，故从植物中直接抽提不是有利的工业制备方法，而人参皂苷Rb!是二醇型皂苷 中的主要单体之一，在不同种类的人参中含量达4.3~11.9%，它与人参皂苷F2的差 别仅在于C-3位和C-20位上各多连接了一个卩-D-葡萄糖基，因此水解人参皂苷Rbi 的糖基是制备人参皂苷F2的一条有效途径。目前采用水解二醇型主要皂苷来得到人参皂苷F2的方法主要有化学法和生物法。化学法主要有加热法(Park. Food Ind.Nutr. 2004, 9: 23-27)、酸水解法(冯仲扬等， 中国药学杂志，1997， 32(12): 772-774)和碱水解法(Im, etal. Kor. J. Ginseng Sci. 1995, 19:291-294)等。这些方法虽然操作简单，但专一性差，许多皂苷元在水解过程中会 发生结构变化，难以得到特定的单体皂苷，同时大量有机溶剂及酸碱的使用还会造 成环境污染。微生物发酵法是使用较广泛的生物转化方法，就是将人参皂苷R^直接加入到3菌株的发酵液中，利用微生物产生的代谢酶来水解。目前已知Rb,在大多数肠道微 生物(Kobashi, et al. Ginseng Rev. 1994, 18: 10-14)和真菌(马吉胜等，药学学报，2001, 36(8): 603-605; Dong， et al. Biotechnol. Lett. 2003， 25: 339-344; Cheng, et al. Biotechnol. Lett. 2006, 28: 1121-1127; Chen, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 77: 1345-1350)的代谢途径都遵循Rbi —> Rd —> F2 _> C-K —> diol，因此可在代谢产物中得到人 参皂苷F2。微生物发酵法专属性较强，条件温和，环境污染少，但存在反应产物成 分复杂、分离繁琐的缺点。酶促水解是一种选择性水解反应，不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类 糖的苷键，从而达到定向水解目的。酶促水解方法效率高，专一性强，而且不存在 微生物发酵法的后分离问题，是一种较为理想的皂苷糖基改造方法。但目前酶水解 人参皂苷的例子还不是很多，主要还是酶源的限制，因此通过筛选适当的酶和反应 条件，获得高含量、且活性较高的次级皂苷和皂苷元仍是值得探索的领域，在制药 工业上也有较大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用酶法特异性水解人参皂苷Rh制备人参皂苷F2的方法，其 特征在于，采用微生物酶在缓冲液中水解人参皂苷Rbp使其转变为人参皂苷F2。 其中酶的加入量为2~50 U/mg底物，底物人参皂苷的加入量为0.5~30 g/L，缓冲液 pH值为3.0~7.0，反应温度为30~70°C,反应时间为2~120小时。本专利技术所提供的酶促水解制备人参皂苷F2的方法中所使用的酶来源于镰孢霉 菌(i^ran'ww/7ra/,/era化附)ECU2042，保藏号为CGMCC No. 1495，是一个相对易得 和便宜的催化剂。本专利技术提供的酶促水解制备人参皂苷F2的方法中，催化剂采用粗酶制剂和固定 化酶两种方式，其中，固定化酶通过粗酶液经壳聚糖吸附及戊二醛交联制得，交联 方法为粗酶液的浓度为0.04-0.24 g蛋白/L，壳聚糖的加入量为50~100 g/L，固定化 的反应体系pH值为6.0~7.0，吸附时间为0.5~15小时，交联剂戊二醛的加入重量/ 体积为0.1°/『1% (w/v)，交联时间为2~20小时。所述的缓冲液推荐为pH值为4.5~6.0醋酸或磷酸盐液。推荐反应温度为45~550C。本专利技术提供了一种利用微生物酶在温和条件下选择性催化水解高丰度人参皂苷 制备更具应用潜力的稀有皂苷的方法。与其它方法相比，本方法不但具有反应条件 温和、专一性强、便于定向控制等诸多优点，而且以微生物为酶源的工艺成本较低， 有利于大批量的制备。用该方法制备人参皂苷F2，所得皂苷的纯度可达到95%以上。具体实施例方式下面将通过实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为更好理解 本专利技术的内容。因此，所举之例并不限制本专利技术的保护范围。实施例1采用查氏培养基培养镰孢霉菌ECU2042，培养基组成蔗糖30 g/l， NaN03 3.0 g/l， K2HP04 1.0g/l， KC10.5g/1， MgS047H20 0.5 g/l， FeS047H20 0.01 g/l。种子液在30°C、 180 rpm摇床中培养18小时后，按4%的接种量接入到500 ml 摇瓶中(装液量100ml)，在同样条件下培养72小时后，过滤收集菌体。采用研磨的方法破碎细胞，细胞破碎液用高速冷冻离心机离心(12,000 rpm， 30 min)，收集上清液，冰浴条件下缓慢加入等体积的冷冻丙酮，继续搅拌30分钟后用 高速冷冻离心机离心，沉淀经真空冷冻干燥即为镰孢霉菌粗酶制剂。实施例2在100 ml磨口三角瓶中依次加入600 mg实施例1中所制得的粗酶，60 mg人 参皂苷Rbp再加入30 ml醋酸盐缓冲液(NaAc/HAc, 0.2 M， pH 5.0)，塞紧磨口塞， 用生料带封口 ，在50°C下200 rpm旋转式摇床上反应72小时后，取样进行HPLC 分析(检测UV203nm;流动相甲醇/水=85/15^/力，转化率约30.5%。实施例3在100 ml磨口三角瓶中依次加入300 mg实施例1中所制得的粗酶，60 mg人参皂苷Rbi，再加入30 ml醋酸盐缓冲液(NaAc/HAc, 0.2 M， pH 5.0)，塞紧磨口塞， 用生料带封口 ，在50°C下200 rpm旋转式摇床上反应72小时后，补加300 mg粗酶， 继续反应48小时，分别加入正丁醇30ml萃取4次，收集正丁醇相，旋转蒸发浓縮 后，经制备色谱柱(Venusil XBP C18)分离，得到16 mg人参皂苷F2，转化率约为 43.2%，收率为87%，制备所得人参皂苷F2的纯度^95%。实施例4在100 ml磨口三角瓶中依次加入500 mg实施例1中所制得的粗酶，50 mg人 参皂苷Rbi，再加入50 ml醋酸盐缓冲液(NaAc/HAc, 0.2 M， pH 5.0)，塞紧磨口塞， 用生料带封口 ，在50°C下200 rpm旋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶促水解人参皂苷Ｒｂ↓［１］制备人参皂苷Ｆ↓［２］的方法，其特征在于，采用专一性的微生物酶在缓冲液中特异性水解人参皂苷Ｒｂ↓［１］，使其转变为人参皂苷Ｆ↓［２］；其中，酶的加入量为２～５０Ｕ／ｍｇ底物，底物人参皂苷的加入量为０．５～３０ｇ／Ｌ，缓冲液ｐＨ值为３．０～７．０，反应温度为３０～７０℃，反应时间为２～１２０小时； 所述的微生物为镰孢霉菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）ＥＣＵ２０４２，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４９５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，苏金环，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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