一种分离病毒变异序列的方法及其分离的口蹄疫病毒变异序列技术

本发明专利技术公开一种分离病毒变异序列的方法及其分离的口蹄疫病毒变异序列，该方法通过先对已报道的病毒变异区域进行分析，并利用随机肽技术，分离得到能够模拟病毒变异的多条多肽，将这些多肽用于疫苗研发，可使得疫苗研制能兼顾病毒的变异，起到未雨绸缪的作用。本发明专利技术还得到口蹄疫病毒的变异序列，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０１～２００所示，对应的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１～１００所示。本发明专利技术的方法操作简单，且可高效地发现病毒新的变异序列，有力地保障了全国畜禽养殖业，为广谱疫苗的开发开辟新途径，也为开发禽流感疫苗、爱滋病疫苗等提供了新的技术方向。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及病毒防疫，尤其涉及一种分离病毒变 异序列的方法及其分离的口蹄疫病毒变异序列。
技术介绍
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、 高度传染性传染病，是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)感染引起的人畜共患的传染病，是当今世界上最为严重的家畜传染病，危害牛、 猪、羊等偶蹄类动物，以传播迅速、感染率高而著称，国际兽疫局将其列为A 类传染病之首。世界上绝大多数国家都流行过口蹄疫，目前该病主要在亚洲部 分国家和地区、非洲、中东和南美呈地方性流行或零星散发。由于病毒的快速变异，口蹄疫疫苗难以对被免疫动物达到有效的保护，已 消灭口蹄疫的国家和地区常常会重新暴发口蹄疫，如1967年，在英国发生了持 续5个月的口蹄疫，为了遏止疾病的蔓延，在几千个流行疫区内有442,000头家 畜被杀掉，1981年英国再次爆发口蹄疫，2000年口蹄疫首先在亚洲和非洲爆发， 继而蔓延至欧洲和美洲，2001年英国又发生口蹄疫，共发现病例2030起，其间 共有400多万头牲畜被屠宰，损失惨重。由于目前控制口蹄疫主要是采取屠宰 措施，因此给畜禽养殖业带来毁灭性打击。当前，控制病毒性疾病最经济有效的手段就是疫苗，然而随着病毒的快速 变异，越来越多的疫苗出现丧失保护作用的现象，如流感疫苗、禽流感疫苗、 乙肝疫苗等都出现这种情况，如何能针对病毒变异快这一情况，提出合适有效的解决方法是目前摆在人们面前的一道难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过对病毒变异区域进 行分析，并结合随机肽技术，分离病毒变异序列的方法。本专利技术的另一个目的在于提供采用上述方法分离得到的口蹄疫病毒变异 序列。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的针对病毒变异速度快，现有疫苗易失去保护作用的现象，本专利技术提供一种 分离病毒变异序列的方法，该方法通过先对病毒变异区域进行分析，然后利用 随机肽技术，分离得到能够模拟病毒变异的多条多肽，将这些多肽用于疫苗研 发，可以使得疫苗研制能兼顾病毒的变异，起到未雨绸缪的作用。本专利技术的分离病毒变异序列的方法，包括如下步骤(1) 分析对比数据库中病毒的氨基酸序列，根据现有对该病毒抗原性的研 究，找出该病毒抗原决定簇位点的编码序列以及高可变区域的编码序列，并设 计混合多肽，根据该混合多肽设计随机引物；(2) 将上述随机引物进行不对称PCR拼接；(3) 将上述拼接产物与酵母分泌表达信号肽序列制备融合基因；将该融合 基因和大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体分别进行双酶切，大肠杆菌-酿酒酵母穿梭 载体在双酶切位点间再多进行一次酶切，且酶切后用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理；将融合基因的双酶切产物和大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体的三 酶切产物连接；(4) 将上述连接产物电激转化大肠杆菌，得到质粒，酶切处理该质粒后，再次电激转化，转化产物经筛选后，挑取克隆进行测序，即分离得到病毒变异 序列。上述步骤(1)中，病毒抗原决定簇位点可选择T细胞抗原决定簇位点、 B细胞抗原决定簇位点等。上述歩骤(2)中，现有对随机引物的拼接有很多种方法，如鸟枪法、限 制性内切酶拼接法等，本专利技术人通过试验发现对随机引物采用不对称PCR拼接，可取得较好的拼接效果，不对称PCR的操作采用本领域常规操作即可。 上述步骤(3)中，为拼接产物加上酵母分泌表达信号肽序列，可使得拼接产物能很好地分泌表达到胞外，易于纯化，酵母分泌表达信号序列可采用任意一种本领域技术人员常用的，如酿酒酵母(x凌配因子(AMF)的信号肽序 列。上述步骤(3)中，大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体可采用任意一种本领域技 术人员常用的，如pYES2/CT、 pYES6/CT或YEp352等。上述步骤(3)中，对大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体进行三酶切，是因为常 规操作——双酶切经常不能酶切彻底，留下少量环状DNA载体，这些没有插 入片段的空载体会形成大量菌落，从而影响阳性菌落的筛选，而本专利技术采用三 酶切处理载体，使得酶切更加彻底，酶切后再进行一歩CIAP处理，使得未插 入目的片段的空载体被切成线性DNA并去磷酸化后不能被转化大肠杆菌，从 而可减少非重组质粒的混入，保证最终获得的均为阳性克隆。上述步骤(4)中，将上述连接产物进行大肠杆菌电激转化并涂板，收菌 并生长后提取质粒，并用限制性内切酶NotI和CIAP处理所提取的质粒，以 彻底去掉没有插入片段的空载体，然后再次电激转化，转化产物涂布于含有花青素的LBGG氨卞青霉素抗性平板，挑取克隆进行测序，即分离得到病毒变 异序列。本专利技术采用上述分离病毒变异序列的方法，对口蹄疫病毒的变异序列进行 了分离，其具体步骤如下(1) 搜索数据库中多个O型口蹄疫病毒(FMDV) VP1蛋白的氨基酸序 列进行分析比对，设计具有E-F-PPS"G结构的混合多肽，其中E段与T细胞 抗原决定簇位点有关，F段与B细胞抗原决定簇位点有关，G段为G-H环区 域，该G-H环区域为口蹄疫病毒中主要的中和性抗原位点，F段与G段之间 由一个二脯氨酸接头(PPS)连接，因为G-H环是O型口蹄疫病毒(FMDV) 上重要的可变区，因此将G段设计为有限随机化的区域；根据该E-F-PPS"G 结构的混合多肽，设计随机引物；(2) 将上述随机引物进行不对称PCR拼接；(3) 将上述拼接产物与酵母分泌表达信号肽序列制备融合基因；将该融合 基因和大肠杆菌"fi酒酵母穿梭载体分别进行双酶切，大肠杆菌-酿酒酵母穿梭 载体在双酶切位点间再多进行一次酶切，且酶切后用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理；将融合基因的双酶切产物和大肠杆菌"l良酒酵母穿梭载体的三 酶切产物连接；(4) 将上述连接产物进行大肠杆菌高效电激转化并涂板，收菌并生长后提 取质粒，并用限制性内切酶NotI和CIAP处理所提取的质粒，使得未插入目的 片段的空载体被切成线性DNA并去磷酸化后不能被转化大肠杆菌，从而可减 少非重组质粒的混入。然后再次高效电激转化，转化产物涂布于含有花青素的 LBGG氨卞青霉素抗性平板，挑取克隆进行测序，即分离得到病毒变异序列。，上述步骤(1)中，从Genebank中搜索到目前已报道的如下多种O型口 蹄疫病毒(FMDV) VP1蛋白的氨基酸顺序AJ294914、 AJ303520、 AJ29491 8、 AJ303521、 AJ296328、 AJ004663、 AJ303522、 AJ303484、 AJ303523、 AJ3 03483、 AJ318833、 AJ318844、 AJ318847、 AJ303525、 AJ303526、 AJ318848、 AJ131469、 AF095884、 AF095885、 AF026168、 AJ296322、 AJ294923、 AJ318 836、 AJ294925、 AJ294922、 AJ294924、 AF525458、 AJ131468、 AJ131470、 A J294917、 AJ294913、 AJ294915、 AJ294916、 AJ294919和AJ294920。根据这 些氨基酸的分析比对，设计出具有E-F-PPS《结构的混合多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离病毒变异序列的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：　（１）分析对比数据库中该病毒的氨基酸序列，找出该病毒抗原决定簇位点的编码序列以及高可变区域的编码序列，设计混合多肽，并设计该混合多肽的随机引物；　（２）将上述随机引物进 行不对称ＰＣＲ拼接；　（３）将上述拼接产物与酵母分泌表达信号肽序列构建成融合基因；将该融合基因和大肠杆菌－酿酒酵母穿梭载体分别进行双酶切，大肠杆菌－酿酒酵母穿梭载体在双酶切位点间再多进行一次酶切，且酶切后用牛小肠碱性磷酸酶处理；将融合 基因的双酶切产物和大肠杆菌－酿酒酵母穿梭载体的三酶切产物连接；　（４）将上述连接产物电激转化大肠杆菌，得到质粒，酶切处理该质粒后，再次电激转化，转化产物经筛选后，挑取克隆进行测序，即分离得到病毒变异序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋云，于雯雯，张潇潇，王建兵，马小倩，周庆丰，阳新明，高晔，
申请(专利权)人：中山大学，广东温氏食品集团有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]