一种肽聚糖识别蛋白-D、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种肽聚糖识别蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种肽聚糖识别蛋白
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D、制备方法及其应用

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[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及肽聚糖识别蛋白
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D的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本专利技术涉及肽聚糖识别蛋白
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D及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、对昆虫合成不同类型抗菌肽影响等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白
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D及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。

技术介绍
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[0002]肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)作为模式识别受体(pattern recognition receptor，PPR)家族的一员，可识别仅存在于病原生物表面的病原相关分子模式(pathogen
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related molecular patterns，PAMPs)实现对外来病原物的感知，进而选择性激活Toll途径、IMD途径、JAK
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STAT途径、活性氧代谢或者黑化反应等途径来清除病原物。
[0003]1996年肽聚糖识别蛋白由Yoshida等(Yoshida,H.；Kinoshita,K.；Ashida,M.Purification of a Peptidoglycan Recognition Protein from Hemolymph of the Silkworm,Bombyx Mori.J.Biol.Chem.1996,271(23),13854
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13860.)在家蚕中首次发现，随后PGRPs在软体动物、棘皮动物和脊椎动物种相继发现。PGRPs含有一个或多个约165个氨基酸残基组成的PGRP结构域。该结构域与N
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乙酰胞壁酸
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丙氨酸酰胺酶同源，与具有酰胺酶活性的噬菌体T7溶菌酶相似性大约30％。通过结构分析发现：PGRP结构域是由位于中心区域的五个β
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折叠和外围的三个α
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螺旋组成的一个倒L型凹槽结构。PGRPs依据蛋白分子量大小和酰胺酶活性划分为不同的类型。按照蛋白分子量大小PGRPs分为长型、中型和短型。按照是否具有酰胺酶活性可将PGRPs划分为有催化活性的PGRPs和非催化活性的PGRPs。具有催化活性的PGRPs可以切断肽聚糖N
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乙酰胞壁酸与L
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赖氨酸之间的酰胺键，将肽聚糖裂解成更小的、没有免疫刺激活力的片段，进而可以降低细菌对IMD途径的刺激。而非催化活性PGRPs不能裂解肽聚糖，但可作为识别受体参与其它免疫反应。
[0004]黄粉虫的TmPGRP
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D可与PGN结合并与TmGNBP1、丝氨酸蛋白酶MSP相互作用激活前体剪切酶，将前体剪切成成熟的前体剪切成成熟的与Toll途径中的Toll受体结合并激活Toll途径合成抗菌肽。与黄粉虫类似，在果蝇中PGRP
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D、SD和革兰氏阴性结合蛋白
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1(GNBP
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1)协同检测细菌细胞壁胞外Lys型PGN，启动Toll通路的激活；而BmPGRP
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S1参与激活IMD通路诱导AMPs表达。酚氧化酶级联反应导致黑色素形成参与昆虫对入侵病原微生物的防御。一些具有受体功能的PGRPs可以通过识别微生物或PAMPs参与酚氧化酶级联反应的激活。在过量表达具有识别受体功能的DmPGRP
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LE和持续激活具有识别受体功能的DmPGRP
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LC可以引发黑化反应。在家蚕中，BmPGRP
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S1结合PGN后可参与酚氧化酶级联反应的激活；在烟草天蛾中，MsPGRP
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1不仅可以识别PGN，还可以参与烟草天蛾的酚氧化酶级联反应；玉米螟PGRP
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S可以在结合S.aureus和B.thuringiensis后激活酚氧化酶级联反应；棉铃虫PGRP
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A也可参与酚氧化酶级联反应的激活。果蝇分泌的PGRP
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SC1、
‑
SC2和
‑
LB具有酰胺酶
活性，可以切割PGN分子。在斑马鱼体内鉴定了3个PGRP基因，分别为PGLYRP
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2(或称zfPGRP2)、PGLYRP
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5(zfPGRP
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SC)和PGLYRP
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6(zfPGRP6)，3个PGRP基因均表现出酰胺酶活性和抗菌活性。
[0005]肽聚糖识别蛋白是为数不多的从低等动物到高等动物都非常保守的模式识别蛋白，对了解宿主免疫调控和免疫相关疾病研究有重要意义。然而，目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫肽聚糖识别蛋白
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D的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。

技术实现思路
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[0006]本专利技术是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的PGRP
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D，研究天然PGRP
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D的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组PGRP
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D及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组PGRP
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D及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
[0007]本专利技术首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然PGRP
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D。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析PGRP
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D的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现PGRP
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D基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组PGRP
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D。同时，利用基因重组技术，获得PGRP
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D的类似物或部分片段。天然、重组PGRP
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D以及其类似物或部分片段，能特异性识别脂多糖、β
‑
1,3
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葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物。上述结合，一方面激活昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统，另一方面影响不同类型昆虫抗菌肽的合成。本专利技术的天然、重组PGRP
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D以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本专利技术的天然、重组PGRP
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D以及其类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
[0008]本专利技术所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Satu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肽聚糖识别蛋白
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D，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白
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D，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白
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D来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。3.编码权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白
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D的基因。4.根据权利要求3所述的肽聚糖识别蛋白
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D的基因，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白
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D的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。5.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白
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D的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有肽聚糖识别蛋白
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D的生物学活性。6.根据权利要求5所述的肽聚糖识别蛋白
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D的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白
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D的衍生物或类似物或活性片段选自Met
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PGRP
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D序列、Met
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His6标签
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PGRP
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D序列、Met
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PGRP
‑
D
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His6标签序列、Met
‑
His6标签
‑
凝血酶酶切位点
‑
PGRP
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D序列、Met
‑
GST标签
‑
凝血酶酶切位点
‑
PGRP
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D序列、Met
‑
PGRP
‑
D
‑
凝血酶酶切位点
‑
GST标签序列、Met
‑
PGRP
‑
D
‑
Flag标签序列、M...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，王夏璐，张景海，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：