一种α9α10nAChR突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体为一种α9α10nAChR突变体及其应用。所述突变体是由野生型α9nAChR的氨基酸序列突变而来，所述突变为所述α9nAChR的氨基酸序列第224位的酪氨酸定点突变为丙氨酸；所述野生型α9nAChR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的α9α10nAChR突变体显著降低了本体α9α10nAChR对ACh的敏感性，可用于制备治疗由α9α10nAChR引起的内耳疾病、慢性疼痛、癌症、寻常型天疱疮和炎症性疾病药物。和炎症性疾病药物。和炎症性疾病药物。

【技术实现步骤摘要】
一种
α9α
10 nAChR突变体及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种α9α10 nAChR突变体及其应用。

技术介绍

[0002]乙酰胆碱受体(AChRs)是自然界普遍存在的一种具有重要生理功能的膜蛋白，能调节生物体一系列的生理功能，如：痛觉、认知、记忆、焦虑等。按照对配体敏感性的不同，AChRs分为毒蕈型乙酰胆碱受体(mAChRs)和烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)两大类。
[0003]烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)广泛分布于肌肉、中枢神经系统和外周神经系统中，与各种疾病的发生密切相关。其中，α9α10亚型是近年来发现的新型乙酰胆碱受体家族成员之一，也是全世界生物医学研究者关注的热点之一。研究显示α9α10 nAChR亚型与人类病理生理状态如慢性疼痛(神经痛)和癌症发展等有关。α9α10 nAChR作为配体门控离子通道，会被ACh激活，α9α10 nAChR功能的激活与抑制是引起上述疾病的重要因素，因此开发出靶向α9α10 nAChR的药物就显得极具价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种α9α10 nAChR的突变体及其应用，所述α9α10 nAChR突变体与本体α9α10 nAChR相比，显著降低了α9α10 nAChR对ACh的敏感性，可用于制备治疗由α9α10nAChR引起的内耳疾病、慢性疼痛、癌症、寻常型天疱疮和炎症性疾病药物。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种α9α10 nAChR突变体，所述突变体是由野生型α9 nAChR的氨基酸序列突变而来，所述突变为所述α9 nAChR的氨基酸序列第224位的酪氨酸定点突变为丙氨酸；所述野生型α9 nAChR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]进一步地，所述α9α10 nAChR突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术提供了编码上述突变体的基因。
[0009]优选地，所述突变体的编码基因序列如SEQ ID No.4所示。
[0010]本专利技术提供了上述α9α10 nAChR突变体在制备治疗由α9α10 nAChR引起的疾病的药物中的用途。
[0011]具体地，所述疾病包括内耳疾病、慢性疼痛、癌症、寻常型天疱疮和炎症性。
[0012]本专利技术的有益效果：
[0013]本专利技术公开的α9α10 nAChR突变体，由野生型α9 nAChR的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)突变而来，所述野生型α9 nAChR的氨基酸序列第224位的酪氨酸定点突变为丙氨酸。实验结果表明：所述突变体与本体α9α10 nAChR相比，显著降低了α9α10 nAChR对ACh的敏感性，可用于制备治疗由α9α10 nAChR引起的内耳疾病、慢性疼痛、癌症、寻常型天疱疮和炎症性疾病药物。
附图说明
[0014]图1是本专利技术α9α10 nAChR突变体对应PCR产物电泳图；
[0015]图2是本专利技术α9α10 nAChR突变体目的基因测序图；
[0016]图3是本专利技术α9α10 nAChR突变体对应质粒，酶切产物和cRNA电泳图；
[0017]图4是本专利技术α9α10 nAChR突变体模型成功构建的电流图；
[0018]图5是本专利技术α9α10 nAChR突变体和α9α10 nAChR对ACh敏感性的测试结果展示；
[0019]图6是本专利技术α9α10 nAChR突变体和α9α10 nAChR对ACh半最大效应浓度的测试结果展示。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021]本专利技术的目的在于提供了一种新的α9α10 nAChR突变体，具体为对野生型α9 nAChR进行如下的定点突变：将224位酪氨酸突变成丙氨酸。野生型α9 nAChR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述α9α10 nAChR突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]本专利技术提供的α9α10 nAChR突变体可用于后续靶向α9α10 nAChR药物的先导化合物的筛选。
[0023]实施例1：
[0024]1.α9亚基突变体的引物设计
[0025]首先从NCBI(National Center for Biotechnology Information(nih.gov))获得大鼠α9 nAChR的基因序列，如SEQ ID NO.3所示，使用SnapGene软件以rα9亚基突变体的突变位点所对应的碱基密码子为中心，在突变位点的上下游设计长度约为22～28bp的正反引物，退火温度控制在60℃左右，随后，将引物序列提交给上海生工合成。针对突变位点设计的引物序列如表1所示：
[0026]表1
[0027][0028]2.PCR介导的定点突变
[0029]首先，rα9质粒模板用灭菌后的dd H2O稀释到浓度为50 ng
·
μl
‑1，引物浓度稀释为1μM，使用50μl定点突变体系，按照表2反应体系在PCR管中依次加入样品，注意先加入正向引物，其次是反向引物，最后加Q5高保真酶，通过聚合酶链反应进行目的基因的突变和扩增。
[0030]表2
[0031][0032]按照表3设置反应程序，循环25次后，加入DpnⅠ酶1μl和rCut smart溶液5μl，37℃反应2h，去除质粒模板。反应完成后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测是否出现特异性条带。
[0033]表3
[0034][0035]结果见图1：PCR产物具有明显的特异性单条带，且条带大小均在5000bp左右，可以确认在该PCR条件下，rα9亚基上突变体可以得到有效扩增，可进行下一步PCR产物转化实验。
[0036]3.PCR产物的转化
[0037]以下无菌操作需在超净台中进行。
[0038](1)取适量碎冰于冰盒中，将从
‑
80℃冰箱中取出的感受态细胞DH5α在冰盒中解冻1～5min，解冻后的细胞呈浑浊状，然后加入5～10μl PCR定点突变产物(PCR产物加入量可根据条带亮度自行调整)，包膜，冰浴30min。此步骤设置对照组，对照组加入等体积的未开封使用的灭菌水。
[0039](2)将(1)中的样品在42℃的水浴锅中热激90s后，迅速取出并置于冰盒中冰浴5min。
[0040](3)向热激后的样品中加入400μl不含抗生素且新鲜的LB液体培养基，于摇床中以37℃培养40～60min。超净台需重新开紫外灭菌。
[0041](4)将样品以5000rpm离心5min，或10000rpm离心10s沉淀细胞，弃去本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α9α10nAChR突变体，其特征在于，所述突变体是由野生型α9nAChR的氨基酸序列突变而来，所述突变为所述α9nAChR的氨基酸序列第224位的酪氨酸定点突变为丙氨酸；所述野生型α9nAChR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的α9α10nAChR突变体，其特征在于，所述α9α10nAChR突变体的氨基酸序列如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗素兰，江秀，朱晓鹏，长孙东亭，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：