一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白及其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白及其制备方法及其应用。为了解决现有NMDAR重组蛋白难以同时兼顾产率和免疫反应源性的问题，本发明专利技术提供的NMDAR重组蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，本发明专利技术的NMDAR重组蛋白具有天然NMDAR蛋白的免疫反应源性，其分子量明显小于天然NMDAR蛋白，使用原核系统表达具有更高的收率，作为抗NMDAR抗体检测的抗原原料，成本大大降低。成本大大降低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白及其制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及抗原制备
，具体涉及一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白及其制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]N
‑
甲基
‑
D
‑
天冬氨酸受体(NMDAR)是三种离子型谷氨酸受体的其中之一，作为离子通道位于人脑中，在人中枢系统的脑神经发育和神经元变化的过程中起到了重要的作用。NMDAR主要作用是神经信号传导感应，一旦NMDAR被激活后打开，带正电荷的离子通过细胞膜以达到传递神经信号的目的。
[0003]NMDAR打开离子通道需要同时结合两个不同的激动剂：谷氨酸和甘氨酸。当与镁离子发生结合后，NMDAR离子通道会随之关闭。NMDAR作为双向胯膜蛋白同时作于神经突触结合前与后，在结合前影响着神经信号得释放以及神经元可塑性，结合后用于调整缓解突触结合后释放的电信号物质，同时调整神经元可塑性。NMDAR蛋白表达过程中的翻译后修饰过程也会对NMDAR表达的位置和通道开合有着巨大的影响。由于这些不寻常的作用模式，NMDAR作为人脑神经产生特异性生理反应的检测器。
[0004]NMDAR蛋白是一个异构四聚体蛋白，其中包含两个甘氨酸结合亚单元GluN1和两个谷氨酸结合亚单元GluN2，不同的亚单元在神经细胞上不同的位置或时间点进行表达，研究表明神经突触上的NMDAR能抵抗神经毒素，而反之突出外NMDAR则会导致细胞凋亡。此外不同亚单元组成的NMDAR的作用主要区别于激动剂的结合效率，离子通过率及通道打开的概率。
[0005]由于NMDAR作用的独特性，其与多种疾病的发病相关，包括帕金森综合征，阿尔兹海默症,亨廷顿病，孤独症，其中最主要的病症为抗NMDAR自身抗体相关性脑炎。抗NMDAR自身抗体相关性脑炎最出被归类为副肿瘤综合征，是由于肿瘤引起的免疫反应与大脑产生交叉反应所引起的后遗症。后期研究发现，具有相关症状的病人样本内都发现了特异性的抗NMDAR自身抗体，这些自身抗体作用与大脑海马体，由此此疾病被命名为抗NMDAR自身抗体相关性脑炎。病理学角度上看，NMDAR所导致的抗NMDAR抗体渗透过大脑皮层至海马体，由此海马体上的NMDAR急剧减少，多项数据显示抗NMDAR抗体渗透入神经中枢并攻击NMDAR会影响和调节病情进展。抗NMDAR自身抗体相关性脑炎会有复发风险，其复发与抗体浓度的降低没有必然联系，由此推断其他生理因素也参与了发病机理。由此，抗NMDAR自身抗体的检测是有助于诊断附肿瘤综合征以及其他相关脑科疾病。
[0006]由于NMDAR蛋白结构呈现复杂的跨膜四聚体结构，其抗原的表达难度高。在检测和诊断的角度而言，抗NMDAR自身抗体针对的抗原表位主要位于甘氨酸结合亚单元GluN1表面。GluN1的各类变种都能被病人样本中的抗NMDAR抗体识别。GluN2亚单体同时表达在细胞表面并与GluN1亚单体结合，GluN2不同变种的表达会对GluN1蛋白的抗原表位造成影响，结合后的GluN1/GluN2互相作用有可能改变GluN1蛋白的空间构型以致改变抗原决定位。由于
膜蛋白跨膜特性及较大的蛋白分子量，通过真核系统表达蛋白的得率极低。并且表达所得到的蛋白折叠与天然蛋白相比也会有一定偏差。因此，如何同时兼顾NMDAR重组蛋白的产率和免疫反应源性是研究的重点。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白，其具有天然NMDAR蛋白的免疫反应源性，其蛋白分子量明显小于天然NMDAR蛋白。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白，其特征在于：所述的NMDAR重组蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0010]本专利技术还提供一种NMDAR核酸片段，所述的NMDAR核酸片段编码所述的NMDAR重组蛋白。
[0011]本专利技术还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含所述的NMDAR核酸片段。
[0012]根据一些优选实施方式，所述的重组表达载体使用表达质粒pGC。
[0013]本专利技术还提供一种宿主细胞，用所述的重组表达载体转染原核细胞得到所述的宿主细胞。
[0014]根据一些优选实施方式，所述的原核细胞为大肠杆菌TG1。
[0015]优选地，采用所述的宿主细胞表达重组蛋白，经纯化得到所述的NMDAR重组蛋白，或将所述的重组表达载体转染至原核细胞表达重组蛋白，经纯化得到所述的NMDAR重组蛋白。
[0016]优选地，采用抗FLAG标签的亲和层析柱进行所述的纯化。
[0017]本专利技术还提供所述的NMDAR重组蛋白在抗NMDAR抗体检测试剂盒中的应用。
[0018]本专利技术还提供一种用于抗NMDAR抗体检测的化学发光检测试剂盒，所述的化学发光检测试剂盒含有所述的NMDAR重组蛋白。
[0019]NMDAR蛋白表达作为原料研发制得化学发光检测试剂盒用于检测含有抗NMDAR自身抗体的样本，以此来确定NMDAR自身抗体水平以及潜在的自身免疫性脑炎的患病可能。
[0020]本专利技术还提供一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白的筛选方法，所述的筛选方法包括如下步骤：
[0021](1)采用核酸酶消化NMDAR cDNA得到NMDAR核酸片段；
[0022](2)将步骤(1)的NMDAR核酸片段通过平末端克隆到噬菌体质粒中，然后转入大肠杆菌中进行噬菌体表达；
[0023](3)提取步骤(2)中的表达NMDAR蛋白片段后的噬菌体，加入包被有抗NMDAR抗体阳性样本的酶标板中，室温孵育，使用含有0.04～0.06％ Tween20的1
×
PBS缓冲液清洗酶标板，使用pH值为2～2.5的甘氨酸溶液解离与抗NMDAR抗体阳性样本结合的噬菌体，将得到的噬菌体溶液的pH值调至6.8～7.2，经扩增后再次加入包被有抗NMDAR抗体阳性样本的酶标板中、孵育、清晰、解离、调pH值至6.8～7.2，共重复3～5次；
[0024](4)将最后一次扩增得到的单克隆菌进行测序，得到多个NMDAR蛋白片段，所述多个NMDAR蛋白片段分别经原核细胞表达、纯化，检测免疫反应强度，选取免疫反应强度最高
的NMDAR重组蛋白。
[0025]优选地，所述的NMDAR cDNA具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0026]优选地，所述的检测免疫反应强度的方法为：使用经原核细胞表达、纯化的NMDAR蛋白片段包被酶标板，使用抗NMDAR抗体阳性样本作为一抗孵育，清洗后使用HRP偶联的抗人IgG Fc端多克隆抗体作为二抗进行孵育，清洗后使用TMB显色剂判断免疫反应强度。
[0027]本专利技术与现有技术相比具有如下优势：
[0028]本专利技术的NMDAR重组蛋白具有天然NMDAR蛋白的免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白，其特征在于：所述的NMDAR重组蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。2.一种NMDAR核酸片段，其特征在于：所述的NMDAR核酸片段编码权利要求1所述的NMDAR重组蛋白。3.一种重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体包含权利要求2所述的NMDAR核酸片段。4.一种宿主细胞，其特征在于：用权利要求3所述的重组表达载体转染原核细胞得到所述的宿主细胞。5.如权利要求1所述的NMDAR重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用权利要求4所述的宿主细胞表达重组蛋白，经纯化得到所述的NMDAR重组蛋白，或将权利要求3所述的重组表达载体转染至原核细胞表达重组蛋白，经纯化得到所述的NMDAR重组蛋白。6.根据权利要求5所述的NMDAR重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用抗FLAG标签的亲和层析柱进行所述的纯化。7.如权利要求1所述的NMDAR重组蛋白在抗NMDAR抗体检测试剂盒中的应用。8.一种用于抗NMDAR抗体检测的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光检测试剂盒含有权利要求1所述的NMDAR重组蛋白。9.一种用于抗NMDAR抗体检测的NMDAR重组蛋白的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括如下步骤：(1)采用核酸酶消化NMDAR cDNA得到NM...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛霄鹏，安鹏远，
申请(专利权)人：迪亚莱博张家港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：